[发明专利]一种快速简便的基因克隆方法

摘要

一种快速简便的基因克隆方法，包括目的DNA片段和目的载体的快速酶切，简便的抽提沉淀方法回收DNA，快速的连接酶连接得到环形DNA分子，然后将连接产物转化细菌后培养，菌落PCR筛选得到正确的基因克隆。本发明的特点在于发明了一种简便快速的抽提沉淀方法来回收酶切好的目的DNA和载体DNA，加上使用Fermentas公司的快速限制性内切酶系统和全式金公司的快速连接酶系统，使整个基因克隆关键步骤的时间缩短了4～5h。本发明提供的克隆方法，适用于各种自备载体、插入片断和酶切位点；适用于各种PCR酶（常规Taq酶及各种高保真酶）的扩增产物；操作简单；精确定向克隆；重组效率高；重复性好；可靠性高。

主权项

一种快速简便的基因克隆方法，其特征在于首先利用快速限制性内切酶系统酶切载体DNA或目的DNA，酶切体系如下：载体或目的DNA           5～20ng或5～20ul10×酶切缓冲液            2.5µl内切酶1                  1.5µl内切酶2                  1.5µl双蒸水              补足至25µl然后利用苯酚和氯仿抽提、乙醇和醋酸钠沉淀DNA的方法来回收酶切的DNA片段，其抽提沉淀体系如下：载体酶切产物抽提上清             20µl基因片段酶切产物抽提上清         20µl乙酸钠                            4µl冷乙醇                           80µl进而离心沉淀得到目的DNA和载体DNA酶切产物的混合物，室温干燥后进行连接，其连接体系如下：沉淀                     0µl5×连接缓冲液            2.0µl连接酶                   0.5µl双蒸水              补足至10µl最后，连接产物转化大肠杆菌，第二天用菌落PCR方法筛选阳性克隆。