[发明专利]一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法

摘要

本发明公开了一种水中沙门氏菌属活体的定量检测方法，该方法根据沙门氏菌的生长特性和invA基因的保守性，采用多管发酵法从水样中初步筛选出以沙门氏菌为主的活体细菌。利用沙门氏菌属通用引物139和141，通过PCR扩增来鉴别沙门氏菌阳性菌落。通过MPN计数方法，定量检测水中的沙门氏菌活体。该方法能够准确检测水中沙门氏菌活体的含量，特异性高，操作简便可行，适用于地表水、污水等多种水样的检测。

主权项

一种水中沙门氏菌活体的定量检测方法，其特征在于，按下列步骤进行：步骤一，样品采集：用预先灭菌的采样瓶采集水样1L，水样采集后立即放入冰盒内保存，6h内进行检测；步骤二，水样的浓缩：对于沙门氏菌浓度低的水样，真空抽滤1000mL水样通过微孔滤膜，过滤完毕后取出滤膜，置于已灭菌的烧杯中，加入10mL磷酸盐缓冲液，该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，用磁力搅拌洗脱滤膜30min；弃滤膜，保存洗脱产物，取洗脱产物1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10‑0、10‑1和10‑2三种稀释度的样品；对于沙门氏菌浓度高的水样，取原水1mL，加入到9mL超纯水中，混匀后再取出1mL，加入到9mL超纯水中，依次梯度稀释，得到10‑0、10‑1和10‑2稀释度的样品；步骤三，水样前增菌：将10‑0、10‑1和10‑2这三种稀释度的样品分别加入前增菌液混匀，每个稀释度做5份，放入37℃恒温培养箱中培养24h；步骤四，选择性增菌：将各个稀释度样品的前增菌产物1mL转入到100 mL选择性增菌液中并混匀，在42℃下进行选择性增菌培养24h；步骤五，平板划线分离：挑取选择性增菌产物，分别在XLD平板和BS平板上划线分离和培养，其中，XLD平板在37℃下培养24h，BS平板在37℃下培养48h；步骤六，阳性菌落的鉴定：培养完毕，观察在XLD和BS平板上生长的菌落形态，分别挑取不同形态的菌落，置于PCR反应管中，以沙门氏菌属通用引物进行扩增，扩增片段长度为284 bp；并对PCR产物在100V下电泳40 min，观察在284 bp位置上是否有明亮的扩增条带出现，若有，则该菌落为沙门氏菌阳性；所述的沙门氏菌属通用引物包括上游引物139和下游引物141，其中：上游引物139的序列为：5'‑ GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA‑3'；下游引物141的序列为：5'‑ TCATCGCACCGTCAAAGGAACC‑3'；步骤七，鉴定XLD和BS两种平板上的阳性菌落，并进行互补计数，对于每个稀释度的样品，对应的XLD平板和BS平板只要有其一是阳性平板，则该稀释度即为阳性；以阳性组合的方式记录平板上阳性菌落的结果，对照MPN表查找对应的MPN值，除以在步骤二中水样浓缩的倍数，得到100 mL水样的沙门氏菌活体含量。