[发明专利]一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法

摘要

一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，其步骤为：首先进行高滴度慢病毒的包装及浓缩，对水牛胎儿成纤维细胞进行感染与筛选，采用显微注射法制作水牛转基因嵌合胚胎，将阳性胚胎移植到受体水牛。采用本发明的方法，成功获得了转外源基因的水牛成纤维细胞和转基因水牛嵌合囊胚，30％以上的体细胞表达外源基因，40％以上的囊胚表达外源基因，并成功获得一头转绿色荧光蛋白GFP基因的转基因水牛。

主权项

一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：(1)高滴度慢病毒包装：采用传代培养的293T细胞以及3质粒包装系统和磷酸钙转染方法进行慢病毒包装，转染时，将3个质粒即15μg载体质粒、10μg包膜蛋白质粒pΔ8.9、5μg包装质粒pVSV‑G和125μLCaCL2于试管中混合均匀，补足体积至500μL，将500μL含磷酸氢二钠、pH值为6.95的TS转化液滴加入上述混合液中，室温静置30min，将质粒混合液逐滴加到293T细胞中，于体积百分比为5％CO2的37℃培养箱中培养，第二天换培养液，转染后48～72h收集病毒，将收集的上清1500rpm离心10min，0.45μm滤器过滤收集病毒原液，将病毒上清以20000rpm离心力、4℃离心2h，用100μL的PBS重悬得到浓缩慢病毒、分装，‑80℃冷冻保存，浓缩后病毒滴度达1×109IU以上，(2)制作水牛转基因体细胞：传代培养4～5代的水牛成纤维细胞用慢病毒原液进行感染，细胞转染时，除DMEM和10％胎牛血清外，加入0～10μg/mlpolybrene，转染第2天，换正常培养液继续培养细胞并传代3次，在荧光显微镜下检测细胞的绿色荧光蛋白GFP表达情况，获得感染率达30％以上的转基因体细胞，(3)制作水牛转基因嵌合胚胎：水牛卵母细胞体外受精后，将慢病毒浓缩液30～70pL注射到水牛IVF受精卵中，与颗粒细胞的单层细胞体外共培养7～9天后，在荧光显微镜下检测囊胚GFP表达情况，筛选获得水牛转基因嵌合胚胎，24％以上转基因胚胎发育至囊胚阶段，40％以上囊胚表达外源基因，(4)转基因水牛生产：将经受精卵原核注射法生产的转基因阳性胚胎移植到自然发情或同期处理发情的代孕母牛子宫内中，一头母牛移植2枚胚胎，2个月后B超观察妊娠状况，对妊娠水牛继续跟踪观察10个月。