[发明专利]一种用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法

摘要

本发明公开了一种用于hPPARγ配体药物细胞模型的方法，它包括以下步骤：第一，用含质量分数为10%FBS的HG-DMEM培养基培养293T细胞；第二，待细胞汇集至90~95%时，采用Lipofectamine2000将重组质粒、报告质粒和内部对照质粒按100:50:1的比例共转染239T细胞，并设立空对照组；转染36h后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；第三，hPPARγ特异性配体阳性药物罗格列酮干预；第四，对上述共转染293T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARα特异性配体WY14643；第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARγ阳性药物罗格列酮，对上述共转染293T细胞反应体系进行干预。本发明具有结果显示该细胞模型具有良好的量-效、时-效反应曲线及反应特异性；且成本低、反应灵敏、特异性好等优点，是真正意义上的生物活性筛选新体系，另外，该模型可通过F/R值绘制的趋势线比较不同药物之间的半数有效浓度（EC50）。

主权项

一种用于hPPARγ配体药物筛选细胞模型的方法，其特征在于：它包括以下步骤：第一，用含质量分数为10% FBS的HG‑DMEM培养基培养293T细胞，选择其生长旺盛的时期，按8×104/孔的密度种24孔板；第二，待细胞汇集至90~95%时，采用Lipofectamine 2000将重组质粒phPPARγ‑IRES2‑EGFP、报告质粒ptk‑PPRE×3‑luc和内部对照质粒pRL‑CMV按100:50:1的比例共转染239T细胞，并同时设立空载体pIRES2‑EGFP对照组；转染36h 后检测转染效率和绿色荧光蛋白GFP的表达情况；第三，hPPARγ特异性配体阳性药物罗格列酮干预；293T细胞培养和质粒共转染同第一、二方法；转染14 h后，更换新鲜的含质量分数为10% FBS的HG‑DMEM培养基，将不同浓度的阳性药物罗格列酮加入到各自的转染培养体系中，药物浓度设置为1‰ DMSO、10‑8 mol/L、10‑7 mol/L、10‑6 mol/L、10‑5 mol/L和10‑4 mol/L，作为量‑效分析研究；同时采用10‑5 mol/L浓度罗格列酮，加入到各自的转染培养体系中，并于8 h、16 h、24 h、36 h 和48 h进行时‑效分析；第四，对上述共转染239T细胞反应体系更换干预药物，采用PPARα特异性配体WY14643，用以检测、确定人工模拟hPPARγ信号通路的细胞模型反应特异性；第五，采用相同浓度序列的全反式维甲酸代替PPARγ阳性药物罗格列酮，对上述3反应体系进行干预，以了解上述体系是否可通过全反式维甲酸激动。