[发明专利]城市垃圾堆肥微生物组分的提取方法

摘要

本发明公开了一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法，它是将城市垃圾堆肥在适合不同菌种生长的固体培养基中分别培养、分离，以及分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养，从而鉴定堆肥中有效微生物的组成。实验结果表明，在城市垃圾堆肥中的优势菌种为枯草芽孢杆菌、放线菌及酵母菌，这些菌种不仅数量多而且有的种类也很多。本发明为今后将采用生活垃圾堆肥分离培养的这些菌种应用于草坪植物建植体系中提供了有力的技术支持。

主权项

一种从生活垃圾堆肥原液中提取微生物组分的方法，它是将城市垃圾堆肥在含高氏Gause一号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基的固体培养基中分别培养分离，分离后的纯菌种接种到液体培养基中进行增殖培养，从而鉴定堆肥中有效微生物的组成，其特征在于按如下的步骤进行：（1）配制固体培养基:烧杯中加一定量的蒸馏水、去离子水或自来水，按配方称取营养成分，加入浓度为0.1g/L EDTA；待全部营养成分配齐后，用质量浓度为100g/L的NaOH或质量浓度为100g/L的HCl调节pH 4.5‑7.2，然后加入缓冲剂，分装，置高压蒸汽灭菌锅内灭菌，冷却备用；（2）菌种分离培养：  1)到平板： 每种培养基倒入3个皿中；  2)制备堆肥稀释液：称取新鲜堆肥10克，放入盛90ml无菌水，振摇约20min，制成10‑1‑ 10‑6稀释度的堆肥溶液； 3)涂布：将上述每种培养基的平板底部或培养基周边用记号笔分别写上10‑4，10‑5，和10‑6 3种稀释度字样，每种培养基每稀释度标记3皿，然后用灭过菌的量程为20~200ul的移液枪分别由10‑4，10‑5和10‑6 3管堆肥稀释液中吸取适量对号放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿放入0.2ml，用无菌玻璃涂棒，在培养基表面皿轻轻地涂布均匀，室温下静置5~10min；  4）培养：将含高氏Gause一号培养基的平板倒置于28℃温室下培养5~7天，马铃薯葡萄糖培养基的平板倒置于28℃温室下培养3~5天，牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养1~2天；（3）配制液体培养基：1)牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.25g；蛋白胨2.5g；NaCl1.25g；水250 m；PH 7.0~7.2，0.1MPa灭菌20min；2）马铃薯葡萄糖培养基：马铃薯40g，葡萄糖4g，水200mL，自然pH，0.1MPa灭菌20分钟；3)高氏合成一号培养基：可溶性淀粉 4g；硝酸钾 0.2g；氯化钠0.1g；三水合磷酸氢二钾0.1g；七水合硫酸镁0.1g；七水合硫酸亚铁0.002g；琼脂4g加入5%的酚溶液2滴，蒸馏水200ml；pH7.2~7.4，0.1MPa灭菌20分钟；（4）接种纯菌种：用灼烧过的接种环取菌种，先将接种环接触一下没长菌的培养基部分，使其冷却以免烫死菌种，然后用接种环轻轻取菌少许，将取有菌种的接种环送入液体培养基中，并使接种环在液体与瓶壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中，接种后塞上棉塞，使液体培养基轻轻摇动，使菌体均匀分布于培养基中，以利生长；（5）菌种的增值培养：将液体培养基放入旋转式摇床进行微生物振荡培养，固定在摇床上的锥形瓶随摇床以200‑250r/min的速度运动，由此带动培养物围绕着锥形瓶内壁平稳转动，摇床恒温30℃，培养24~48h后，各培养基变混浊，表明各菌种已在培养基中生长，置于冰箱中保存，得出堆肥微生物的组成菌种。