[发明专利]一种双歧杆菌多糖分离纯化的方法

摘要

本发明涉及一种双歧杆菌多糖分离纯化的方法，主要由下述步骤组成：将双歧杆菌菌种接种在培养基经35-38℃厌氧发酵后，离心浓缩获得双歧杆菌菌体浓缩物；再经高压破碎菌体细胞壁；水提醇沉淀法提取双歧杆菌多糖成分，阴离子交换层析和凝胶过滤层析反复色谱纯化，真空冷冻干燥双歧杆菌多糖的提取物，即得双歧杆菌多糖。利用本发明制备的双歧杆菌多糖能够最大限度分离纯化双歧杆菌多糖，既不影响多糖天然的结构又能保持其原有生物活性，且本发明的方法设备及环境要求低、方法简便、成本低、灵活实用，利于推广、开发和应用。

主权项

一种双歧杆菌多糖的分离纯化方法，由下列步骤实现：(1)双歧杆菌发酵及其菌体浓缩：本发明所涉及到的双歧杆菌包括青春型双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。将双歧杆菌种子液接入已经灭菌后的每100ml培养基中含有：大豆蛋白胨1‑1.5g，鱼胨1‑1.5，葡萄糖2g，牛肉膏0.5‑2g，酵母膏0.5‑2g，K2HPO40.2‑0.6g。经35‑38℃厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得双歧杆菌菌体浓缩物。(2)细胞破壁：将该双歧杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1∶3‑1∶5)，使用高压细胞破碎机操作压力100MPa左右以高压破碎菌体细胞壁。(3)脱脂：将破壁粉碎的双歧杆菌菌体，用有机溶剂以常规方式脱脂；(4)水提：步骤(1)所得的脱脂后双歧杆菌菌体粉末按1∶6％(g/ml)的料液比加入蒸馏水，室温下浸提20～25小时；以3000～5000rpm离心15～30min，取上清液，得双歧杆菌多糖水提物溶液；(5)去蛋白：步骤(2)所得双歧杆菌多糖水提物溶液用有机溶剂以常规方式去除其蛋白；(6)透析：步骤(3)所得的水提物浓缩，离心，弃不溶物，得上清液，用透析袋将上清液在流水中透析48小时，再在去离子水中透析24小时，进一步去除寡糖、无机盐、色素等小分子杂质，收集双歧杆菌多糖的提取液；(7)纯化：将经步骤(4)透析后的液体浓缩，以DEAE纤维素‑52和葡聚糖凝胶层析，收集液用苯酚硫酸法检测，合并多糖峰的收集液，真空冷冻干燥，得层析纯双歧杆菌多糖。