[发明专利]一种4-1BBL蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法是采用小鼠4-1BBL(TNFSF9，NP_033430.1)胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制备含206个氨基酸残基(Arg 104-Glu 309)的重组4-1BBL蛋白。采用本发明方法，可大量获得4-1BBL蛋白，大大提高了蛋白得率，获得的4-1BBL胞外段蛋白可以应用于制备对4-1BBL蛋白定量的临床前研究试剂盒或药用，应用前景广阔。

主权项

一种4‑1BBL蛋白的制备方法，所述方法包括：(1)取含4‑1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞，conA体外刺激培养后经trizol裂解，抽提得到mRNA；(2)将mRNA逆转录得到4‑1BBL胞外段蛋白的cDNA；(3)对步骤(2)所得cDNA进行PCR扩增，得到4‑1BBL蛋白目的基因；PCR扩增引物为：上游引物：5’‑CTC GAG AAA AGA AGAACC GAG CCAAGA CCT‑3’，下游引物：5’‑GAA TTC TTC CCATGG ATT ATC AGG‑3’；(4)将步骤(3)PCR产物用Xho I和EcoR I双酶切后定向插入经同样双酶切的ppic9，获得重组质粒ppic9‑4‑1BBL；(5)将重组质粒ppic9‑4‑1BBL转化至大肠杆菌DH5α，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；(6)将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；(7)将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化，得到纯化的4‑1BBL重组蛋白。