[发明专利]采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法

摘要

采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，涉及一种采用秀丽线虫对可溶性重金属进行涵盖多个连续世代的持久性暴露，从而检测该重金属在长期、低浓度条件下的毒性效应的方法。本发明确定了无重金属存在下、不影响虫卵正常孵化的虫卵起始浓度，以及能够满足其生长发育所需的食物起始浓度，在暴露时间、暴露剂量尤其是食物与重金属共存等方面更加贴近实际环境暴露情形，不同世代之间相同指标的相互比较，获得该重金属在长期实际环境暴露情形下的毒性传递的强弱、传递的途径等。本发明弥补了现有采用秀丽线虫进行毒性测试方法的不足，具有明确的针对性，对模拟实际环境暴露情形下的毒性研究方法进行了补充和扩展。

主权项

采用秀丽线虫检测可溶性重金属持久性毒性的方法，包括A，依照急性毒性测试方法，以秀丽线虫成虫作为受试生物，测得该重金属的急性LC50值，在急性LC50值的1/10下设置3个重金属浓度和1个空白对照，其特征是：B，利用无菌具刻度的15mL离心管，采用同步化方法获得秀丽线虫虫卵，然后向15mL离心管中加入10mL无菌K‑溶液，混匀，采用体视镜观察40μL该混合液的虫卵数量，若虫卵数量多于500枚，则向离心管中再加入2mL无菌K‑溶液后再混匀、观察；若虫卵数量少于300枚，则静置沉淀10min，去除2mL上清液后再混匀、观察；直至将虫卵浓度稀释为每40μL含有400枚虫卵为止，此批虫卵为第一批进行染毒的虫卵，标记为卵液P0，待用；C，采用LB液体培养基在37℃、200rpm条件下将E.coli OP50培养24h至48h，混匀后倒入已灭菌的15mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入8mL无菌K‑溶液混匀，以24孔板为容器、以酶联免疫检测仪为检测仪器，测定每300μL该混合液在570nm处的吸光度，若吸光度值小于1.1或大于1.3，则将混合液重新离心，弃上清液，保留沉于底部的菌体，加入6mL或10mL无菌K‑溶液混匀，再次测定混合液在570nm处的吸光度，通过减少或增加无菌‑K溶液的体积将吸光度值调整至1.1与1.3之间，此时E.coli OP50的总量为108至109个，该数量条件下的菌个数能够为B步骤所得秀丽线虫虫卵的正常生长发育提供足够的食物，标记为菌液，待用；D，采用无菌透明的24孔板进行染毒，先将C步骤获得的菌液摇匀，向24孔板的每孔中加入300μL该菌液，将B步骤稀释好的卵液摇匀，向24孔板的每孔中加入200μL该卵液，将24孔板划分为4行、6列，这些含有虫卵的24孔，每行作为一组、4行共4组对应于A步骤确定的4个浓度梯度，对秀丽线虫进行染毒；在24孔板的孔与孔之间加入1mL无菌K‑溶液以减少染毒期间，蒸发对染毒体系的影响；可根据实际需要对所采用的24孔板的个数及相关布局进行调整；将24孔板置于20℃条件下培养并开始计时；E，在D步骤计时的96h后，从每行中随机移取1孔中的秀丽线虫用于测定相关指标，均标记为P0的各指标值；F，将24孔板中4个浓度梯度对应的混合液分别吸取到4个无菌的15mL离心管中，用1mL无菌K‑溶液冲洗24孔板每一孔中残留的虫体，并将冲洗液转移至相应的离心管中，静置沉淀15min，弃上清液保留沉淀，采用同步化方法，获得4个浓度梯度对应的4组虫卵，然后依照步骤B中的方法，以无菌K‑溶液为稀释液，将4个离心管中的虫卵浓度分别稀释为每40μL含有400枚虫卵，此批虫卵为母代的子一代虫卵，标记为卵液F1，待用；重复步骤C获得菌液，按照与步骤A相同的受试浓度梯度、重复步骤D、E，获得标记为F1的各指标值；G，重复步骤F，获得子二代F2、子三代F3直至第x代子代Fx的各指标；H，依照E、F、G步骤中获得的各代秀丽线虫的指标值之间的显著性差异分析结果，参照传统方法将该可溶性重金属的持久性毒性类别分为：不具有明确的持久性毒性、有延迟性的持久性毒性、具有可被修复的毒性、具有明确并且不可修复的持久性毒性。