[发明专利]鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法

摘要

本发明公开了鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，为了能准确、快速的检测nsp2基因缺失的猪繁殖与呼吸系统综合征变异病毒，在nsp2基因核苷酸序列上设计了一条上游引物和两条下游引物，其中一条下游引物设计在缺失碱基序列区域。通过条件优化建立了区分传统株和高致病性nsp2基因缺失株的PCR方法；并将最优化条件运用于SYBR Green荧光定量PCR分析，建立了根据熔解曲线鉴别nsp2缺失变异株的荧光定量PCR方法，灵敏度达到可检出3-6个基因拷贝。与常规PCR相比，本发明的荧光定量PCR方法能快速准确的检测出传统株和缺失株，灵敏度约比常规PCR高10倍。

主权项

鉴别猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒传统毒株和高致病毒株的荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)准备材料提供已克隆PRRSV高致病性毒株TJ‑H1和传统毒株TJ‑H3的nsp2基因的质粒TJ‑H1nsp2‑T和TJ‑H3 nsp2‑T，并提取该质粒的DNA；(2)设计引物运用DNAMAN软件对nsp2基因缺失的PRRSV高致病性毒株TJ‑H1与传统株TJ‑H3的nsp2基因的核苷酸序列和GenBank数据库中其他株PRRSV的nsp2基因序列进行比对，找出缺失部分的核苷酸序列和所有参与比对的PRRSV株的nsp2基因序列高度保守区域，利用Primer Premier5.0引物设计软件，在缺失区域上游的高度保守区域设计一条上游引物nsp2‑1，在缺失区域设计一条下游引物1nsp2‑2，在缺失区域下游的高度保守区域设计一条下游引物2nsp2‑3；(3)PCR反应体系及其反应程序和参数的优化分别以TJ‑H1 nsp2‑T和TJ‑H3 nsp2‑T质粒DNA为模板，对退火温度、循环次数、引物浓度及双重PCR反应中三条引物的最佳浓度配比进行优化，确定PCR反应的最佳条件；(4)检测最佳PCR反应条件下的PCR反应特异性和敏感性利用步骤(3)优化的PCR反应的最佳条件，以TJ‑H1nsp2‑T和TJ‑H3nsp2‑T质粒DNA为模板，各自分别用nsp2‑1，nsp2‑2引物对、nsp2‑1，nsp2‑3引物对和nsp2‑1，nsp2‑2，nsp2‑3引物对进行扩增，确定PCR反应的特异性；将TJ‑H1nsp2‑T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自用nsp2‑1，nsp2‑3引物对进行扩增；以及将TJ‑H3 nsp2‑T质粒DNA进行10倍梯度稀释后作为模板，各自分别用nsp2‑1，nsp2‑3引物对、nsp2‑1，nsp2‑2，nsp2‑3引物对进行扩增，确定PCR反应的灵敏性；(5)实时荧光定量聚合酶链反应，建立标准曲线利用步骤(3)优化的PCR反应体系，将已知拷贝数的TJ‑H3nsp2‑T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自分别用nsp2‑1，nsp2‑2引物对、nsp2‑1，nsp2‑3引物对和 nsp2‑1，nsp2‑2，nsp2‑3引物对进行实时荧光定量PCR扩增；以及将已知拷贝数的TJ‑H1nsp2‑T质粒DNA进行10倍梯度稀释作为模板，各自用nsp2‑1，nsp2‑3引物对进行实时荧光定量PCR扩增，扩增反应的程序和参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，得到相应的熔解曲线，最后进行标准曲线的绘制；(6)未知样本的检测用总RNA提取试剂提取待测样本细胞的总RNA，焦碳酸乙二酯水溶解后置‑40℃冰箱备用，以该总RNA的反转录产物作为模板，利用步骤(3)优化的PCR反应体系，用nsp2‑1，nsp2‑3引物对进行SYBR Green实时荧光定量PCR反应，扩增反应的程序和参数参数为：95℃10min，1个循环；95℃15s，57℃45s，40个循环，检测结果与步骤(5)中建立的标准曲线进行比较，并根据其熔解曲线鉴别该样本是否为PRRSV高致病性毒株TJ‑H1。