[发明专利]野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法

摘要

本发明采用同源基因克隆法结合RACE方法设计逆转录引物，从野葛根中克隆得到了野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4。本发明的野葛葡糖基转移酶基因的核苷酸序列及其编码的蛋白序列以及基因克隆方法，可广泛应用于野葛品质的改良，尤其是野葛作为药用植物的开发和利用等领域。

主权项

野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法，包括以下步骤：1)  提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；2)  以cDNA为模板，以简并引物UGTD‑F：5′ TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3′（SEQ ID NO.1）和UGTD‑R：5′ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3′（SEQ ID NO.2）为引物，进行温度梯度PCR，得到cDNA，其反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，54℃～63℃30s ，72℃延伸30s，20～40个循环，最后72℃延伸10min，得到中间序列；3)  以步骤1）得到的总RNA为模板，3′ RACE T：5′ GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3′（SEQ ID NO.3）为引物反转录得到cDNA；4)  以上一步骤得到的cDNA为模板，巢式PCR得到野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的3′ 末端序列；5)  以步骤1）得到的总RNA为模板，采用TaKaRa公司5′‑Full RACE Kit 获得野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的5′ 末端序列；6)  将中间序列、3′ 末端序列、5′ 末端序列用SeqMan拼接得到PlUGT4的cDNA序列，根据拼接得到PlUGT4的cDNA序列设计引物PlUGT4F：ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG（SEQ ID NO.4）和PlUGT4R：TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC（SEQ ID NO.5），以步骤1）得到的cDNA为模板，PCR得到野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的开放阅读框（ORF）蛋白cDNA序列。