[发明专利]储存宫内膜干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种储存宫内膜干细胞的方法，依次包括以下步骤：1）准备采集套装和配制培养基；2）经血收集；3）无菌检查；4）宫内膜干细胞分离培养：将步骤2）所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Chang完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*105~1*106/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中进行培养；5）细胞扩增和纯化；6）细胞冻存。采用本发明的方法能获得纯度较高、数量较大的目标细胞即宫内膜干细胞。

主权项

储存宫内膜干细胞的方法，其特征是依次包括以下步骤： 1）、准备采集套装和配制培养基：采集管1：装有20ml Hank's平衡盐溶液，并添加以下成分至以下浓度：万古霉素60~100 µg/mL、头孢氨苄150~350 µg/mL、卡那霉素50~150 µg/mL、庆大霉素80~160 µg/mL、两性霉素B 2~3µg/mL及300~500单位肝素；采集管2：装有10ml Hank's平衡盐溶液，并添加150~250单位肝素； 配制Chang 完全培养基：在无菌条件下，在无菌容器中加入65mL MEM‑alpha 培养基、16~20mL Chang B基液、1~3mL Chang C基液、1~3mL青霉素或者链霉素、1~3mL浓度为 200 mM的L‑谷氨酰胺、10~20mL的胎牛血清，充分混匀，置4℃冰箱待用； 2）、 经血收集：收集月经开始的第二或第三天的经血；在采集管1内加入15~20ml的经血，在采集管2内加入5~10ml的经血；并于0~4℃的低温下保存，所述保存期　≤48h；3）、无菌检查：  将采集管2将离心处理后，得上清液；将所述上清液按照血培养法进行厌氧菌和需氧菌检查，并鉴定；若为阳性结果，则结束整个储存宫内膜干细胞的程序；4）、宫内膜干细胞分离培养：将步骤2）所得的采集管1内的混合液先进行过滤，然后采用密度梯度离心法，收集单个核细胞；将上述所得的单个核细胞接种于Chang 完全培养基中，单个核细胞的接种密度为1*105~1*106/ml，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中进行培养；5）、细胞扩增和纯化：待步骤4）的单个核细胞接种于Chang 完全培养基中开始细胞培养的4~5天后，更换Chang 完全培养基，并弃除未贴壁细胞；以后每3~4天全量换液一次；待细胞生长达到80%~90%融合时，用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞，然后按5000‑6000个/cm2密度传代接种培养，并记为P1代；6）、细胞冻存：待步骤5）的P1代细胞铺满容器底部后，用质量百分含量为0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞；从而使细胞的密度为1~2*106/ml；所述冻存液为：在9体积份的Chang 完全培养基中加入1体积份的DMSO制备而得；将上述被冻存液重悬的细胞进行冻存，冻存步骤如下：第一步 ：4℃，等待；第二步 1.0℃/分钟降至‑3.0℃；第三步 10.0℃/分钟降至‑20.0℃；第四步 1.0℃/分钟降至‑40.0℃；第五步 10.0℃/分钟降至‑90.0℃；第六步 结束；取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。