[发明专利]提取莲细胞核DNA的方法

摘要

本发明公开了一种提取莲细胞核DNA的方法；涉及分子生物学领域中提取DNA的方法。其主要步骤是：向研磨成细粉状的莲黄化苗叶片中加入细胞核提取缓冲液，经磁力搅拌、过滤、离心、漂洗后，得到纯化细胞核；加入细胞核裂解缓冲液于65℃水浴，经氯仿：异戊醇萃取和异丙醇沉淀后，得到絮状DNA沉淀物；经70%乙醇洗涤和室温干燥后，加Tris-EDTA缓冲液溶解DNA，于-20℃保存备用。通过本发明所获得的DNA为高质量的莲细胞核DNA，叶绿素DNA和线粒体DNA含量低，所含多糖、多酚、色素和蛋白质少。本发明适用于构建BAC文库和基因组测序等方面所需高质量细胞核DNA的提取。

主权项

提取莲细胞核DNA的方法，其特征在于下列步骤：①称取20克黑暗条件下培养的剔除叶柄的莲黄化苗叶片，放置到经‑20℃预冷5‑6小时的研钵中，再倒入适量的液氮，经快速研磨后得到细粉状样品；②将细粉状样品转移至装有200毫升、4℃预冷1‑2小时的细胞核提取缓冲液SolutionⅠ的烧杯中，并在冰上用磁力搅拌器搅拌20分钟，得搅拌混合液；③将搅拌混合液用两层纱布和两层Miracloth滤布过滤后，收集滤液，并转至50毫升离心管中，置于冷冻离心机上在4℃、1800 rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液；④向白色沉淀物中加入40毫升SolutionⅠ缓冲液，轻轻晃动使之混合均匀，置于冷冻离心机上在4℃、1800 rpm离心20分钟，离心管内溶液上下分层，上层为溶液状，下层为白色沉淀物，弃去上层溶液； 重复步骤④两次，得到的白色沉淀物，即为纯化的细胞核；⑤向纯化细胞核内加入5毫升65℃的细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ，并加入10微升、浓度为10mg/ml的核糖核酸酶溶液，轻轻转动使之混合均匀，在65℃的水浴锅中放置30分钟，期间上下颠倒混合一次，得混合液；⑥向混合液中加入5毫升的氯仿：异戊醇萃取液，上下颠倒混匀，然后在室温下静置5分钟，再于离心机上12000 rpm离心15分钟，离心管内溶液上下分层，上层为水相，下层为有机相；⑦吸取上层水相至另一50毫升离心管中，并加入4毫升的异丙醇，轻轻摇动混匀，再置于‑20℃的冰柜中30分钟，沉淀出絮状的莲细胞核DNA；⑧用牙签挑出絮状的DNA沉淀物至另一容量为2毫升的离心管中，加入1毫升70%乙醇洗涤液，轻轻摇动以充分洗涤DNA沉淀物，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液； ⑨再次加入1毫升70%乙醇洗涤液，对DNA沉淀物进行洗涤，然后倾斜离心管，小心倒出洗涤液，将离心管放置于超净工作台上3‑4小时，以吹干离心管内残留的乙醇洗涤液，并干燥DNA沉淀物；⑩向离心管中加200微升的Tris‑EDTA缓冲液，轻轻摇动至DNA沉淀物充分溶解，然后将离心管放入‑20℃冰柜中保存；其中：细胞核提取缓冲液SolutionⅠ的组分三羟甲基氨基甲烷          10 毫摩尔/升；乙二胺四乙酸              10毫摩尔/升；氯化钾                    80毫摩尔/升；蔗糖                      0.5 摩尔/升；聚乙二醇辛基苯基醚        0.5%；亚精胺                    1毫摩尔/升；精胺                      1毫摩尔/升； 聚乙烯醇吡咯烷酮‑30       2%；β‑巯基乙醇               0.15%；pH为9.4‑9.5；细胞核裂解缓冲液SolutionⅡ的组分三羟甲基氨基甲烷          50 毫摩尔/升；乙二胺四乙酸              5毫摩尔/升；山梨糖醇                  350毫摩尔/升；氯化纳                    710毫摩尔/升；十二烷基硫酸钠            1%；十六烷基三甲基溴化铵      0.1%；β‑巯基乙醇               0.1%；pH为7.9‑8.0。