[发明专利]表达猪肺炎支原体p46蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌及制备方法与应用

摘要

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一株不含抗性标记表达猪肺炎支原体p46蛋白的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA‑46)，其保藏号为CCTCC NOM2011106，该重组株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长所必需的asd基因，含有能在该重组株中表达asd基因和猪肺炎支原体p46蛋白的质粒。本发明还公开了该重组株制备猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎疫苗的方法及其应用。本发明制备的二价疫苗可刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体的免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体的感染。

主权项

一株重组的猪霍乱沙门氏菌株(Salmonella choleraesuis)C500(pYA‑46)，其特征在于，所述的菌株的保藏号为CCTCCNO：M2011106，它是通过如下方法制备得到的：1)用如下所示的引物对扩增猪肺炎支原体膜蛋白p46的基因片段，并将其亚克隆至原核表达载体pGEX‑KG中，构建得到重组质粒pGEX‑46，所述引物对的核苷酸序列如下所示：正向引物：CCCGGATCCATGAAAAAAATGCTTA，反向引物：CCCAAGCTTTTAGGCATCAGGATTA；该重组质粒包含有一种能够原核表达猪肺炎支原体的主要免疫原性膜蛋白‑p46蛋白的基因片段，该基因片段的核苷酸序列如下所示：ATGAAAAAAA TGCTTAGAAA AAAATTCTTG TATTCATCAG CTATTTATGC AACTTCGCTTGCATCAATTA TTGCATTTGT TGCAGCAGGT TGTGGACAGA CAGAATCAGG TTCGACTTCAGATTCTAAAC CACAAGCCGA GACTCTAAAA CATAAAGTAA GTAATGATTC TATTCGAATAGCACTAACCG ATCCGGATAA TCCTCGATG(A/G)ATTAGTGCCC AAAAAGATAT TATTTCTTACGTCGATGAAA CAGAGGCAGC AACTTCAACA ATTACAAAAA ACCAGGATGC ACAAAATAACTG(A/G)CTCACTC AGCAAGCTAA TTTAAGTCCA GCGCCAAAAG GATTTATTAT TGCCCCTGAAAATGGAAGTG GAGTTGGAAC TGCTGTTAAT ACAATTGCTG ATAAAGGAAT TCCGATTGTTGCCTATGATC GACTAATTAC TGGATCTGAT AAATATGATT GGTATGTTTC TTTTGATAATGAAAAAGTTG GCGAATTACA AGGTCTTTCA CTTGCGGCGG GTCTATTAGG AAAAGAAGATGGTGCTTTTG ATTCAATTGA TCAAATGAAT GAATATCTAA AATCACATAT GCCCCAAGAGACAATTTCTT TTTATACAAT CGCGGGTTCC CAAGATGATA ATAATTCCCA ATATTTTTATA(A/G)TGGTGCAA TGAAAGTACT TAAAGAATTA ATGAAAAATT CGCAAAATAA AATAATTGATTTATCTCCTG AAGGCGAAAA TGCTGTTTAT GTCCCAGGAT GGAATTATGG AACTGCCGGTCAAAGAATCC AATCTTTTCT AACAATTAAC AAAGATCCAG CAGGTGGTAA TAAAATCAAAGCTGTTGGTT CAAAACCAGC TTCTATTTTC AAAGGATTTC TTGCCCCAAA TGATGGAATGGCCGAACAAG CAATCATCAA ATTAAAACTT GAAGGATTTG ATACCCAAAA AATCTTTGTAACTGGTCAAG ATTATAATGA TAAAGCCAAA ACTTTTATCA AAGACGGCGA TCAAAATATGACAATTTATA AACCTGATAA AGTTTTAGGA AAAGTTGCAG TTGAAGTTCT TCGGGTTTTAATTGCAAAGA AAAATAAAGC ATCTAGATCA GAAGTCGAAA ACGAACTAAA AGCAAAACTACCAAATATTT CATTTAAATA TGATAATCAA ACATATAAAG TGCAAGGTAA AAATATTAATACAATTTTAG TAAGTCCAGT AATTGTTACA AAAGCTAATG TTGATAATCC TGATGCCTAA在上述序列的210bp、303bp和662bp处的分别存在A210‑G210；A303‑G303；A662‑G662的人工碱基定点突变；2)利用三对引物将猪肺炎支原体的p46蛋白基因片段210bp、303bp和662bp处的碱基A定点突变为 碱基G，所用引物的核苷酸序列如下所示：正向引物：AATCCTCGATGGATTAGTGCC，反向引物：CCATCGAGGATTATCCGGAT；正向引物：CAAAATAACTGGCTCACTCAG，反向引物：CCAGTTATTTTGTGCATCCTG；正向引物：TCCCAGGATGGAATTATGGAA，反向引物：CCATCCTGGGACATAAACAGC。