[发明专利]一种含有转基因位点的番茄株系的制备方法

摘要

本发明公开了一种含有转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤：A、T0代含有转基因位点的番茄转化苗的制备；B、T0代番茄转化苗中筛选出稳定表达的个体：a)T0代转化苗进行PCR筛选；b)T0代转化苗进行杂交检测其中外源基因的拷贝数；c)T0-11转化苗进行GUS染色；C、T0-11株系与未转化的番茄进行杂交获得F1代：将未转化的番茄的花粉收集涂抹在T0-11株系的雌蕊上，获得了F1代的种子；D、F1代个体的遗传稳定性鉴定：a)PCR初步筛选分离出不含有转基因位点的个体；b)含有转基因位点的F1代个体T-DNA完整性；c)F1代个体中T-DNA的遗传稳定性。

主权项

一种含有转基因位点的番茄株的制备方法，其步骤是：A、T0代含有特定转基因位点的番茄转化苗的制备：通过农杆菌介导的子叶侵染法，将载体pYWP72转化到番茄HW0160株系中，获得含有转基因位点的T0代番茄转化苗；T0代番茄转化苗中筛选出稳定表达的个体：   a ) T0代转化苗进行PCR筛选：提取T0代转化苗的基因组DNA，进行PCR检测，引物从上游35S启动子和下游nptII基因内部设计，鉴定为转基因苗，通过扩增的结果得出T0代转化苗含有nptII抗性基因，表型与未转化的株系无差异；b ) T0代转化苗进行Southern杂交检测其中外源基因的拷贝数：13株T0代转化苗的基因组DNA进行酶切，限制性内切酶为XbaI，探针是由gus基因内部设计引物合成，有1株为含有单拷贝外源基因的转化株，命名为T0‑11；c ) T0‑11转化苗进行GUS染色：T0‑11的幼嫩叶片经GUS染色液染色，然后在酒精中脱色，去掉叶绿素的干扰背景后，叶片的叶脉呈蓝色；T0‑11株系与未转化的番茄进行杂交获得F1代：T0‑11株系的花朵去雄，将未转化的番茄的花粉收集涂抹在T0‑11株系的雌蕊上，该组杂交获得了10粒F1代的种子；F1代个体的遗传稳定性鉴定：a ) PCR初步筛选分离出不含有转基因位点的个体：T0‑11株系不是纯合体，在F1代中发生分离，同样用筛选T0代转化苗的引物对检测F1代个体中含有nptII基因，将不含有该基因的个体剔除出去，结果有6株F1代个体中依然检测到nptII基因；b ) 含有转基因位点的F1代个体的T‑DNA完整性：在T‑DNA插入的左边界和右边界处分别设计引物对P1+P2和P3+P4，通过PCR扩增鉴定T‑DNA的完整性，6株含有nptII基因的F1代个体的插入位点是完整的，没有发生丢失；c ) F1代个体中T‑DNA的遗传稳定性：在gus基因和nptII基因内分别设计引物合成探针，6株F1代个体的基因组DNA作为模板，经HindIII限制性内切酶酶切之后，杂交nptII探针，得到大小为2275 bp的片段；经BamHI限制性内切酶酶切之后，杂交gus探针，得到大小为6077 bp的片段，与载体pYWP72的结构吻合，6株F1代个体在遗传到后代中没有发生基因的丢失或重排。