[发明专利]一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法

摘要

本发明属于混合多肽领域，提供一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法，该方法含有以下步骤：(克隆家蝇cecropin A和ubiquitin序列；构建pET32a-mc重组质粒；将ubiquitin基因扩增序列和pET32a-mc重组质粒酶切后相连，得到pET32a-ubiquitin&MC重组质粒；将pET32a-ubiquitin&MC重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，经筛选，取阳性细胞，加入IPTG进行诱导表达，收集菌体进行超声波破碎，经纯化分离，得到Trx&MC融合蛋白质；采用胃蛋白酶对Trx&MC融合蛋白质进行水解得到获得家蝇Cecropin A天然成熟肽。该方法在大肠杆菌内高产量制备抗菌肽蛋白，产量高，成本低，可商业化大规模生产。

主权项

一种家蝇抗菌肽Cecropin A的制备方法，该方法由以下步骤组成：(1)裂解家蝇的幼虫组织，提取其总RNA，然后进行RT‑PCR扩增，分别得到cecropin A基因片段和ubiquitin基因片段；(2)将cecropin A基因片段和ubiquitin基因片段分别与pMDTM18‑T载体连接，并转入DH5α大肠杆菌，分别得到转cecropin A基因的大肠杆菌和转Ubiquitine基因的大肠杆菌；(3)先从转cecropin A基因的大肠杆菌提取出pMD18‑T‑cecropin A重组质粒，再对pMD18‑T‑cecropin A重组质粒进行PCR扩增，将纯化得到的Cecropin A成熟肽基因片段与pET32a载体分别酶切后相连并转入DH5α大肠杆菌，然后提取出pET32a‑MC重组质粒；接着，将转Ubiquitine基因的大肠杆菌进行PCR扩增，将纯化得到的ubiquitin基因与pET32a‑MC重组质粒分别酶切后相连并转入DH5α大肠杆菌，然后提取出pET32a‑ubiquitin&MC重组质粒；(4)将pET32a‑ubiquitin&MC重组质粒转入BL21(DE3)感受态细胞，筛选，取阳性细胞，加入IPTG进行诱导表达，收集菌体，进行超声波破碎，纯化分离，得到Trx&MC融合蛋白质；(5)采用胃蛋白酶对Trx&MC融合蛋白质进行水解得到获得家蝇抗菌肽Cecropin A；其中，所述的RT‑PCR扩增引物分别为：Cecropin A上游引物序列为5’‑ATGAATTTCAATAAATTATTTG‑3’(SEQ NO.1)，Cecropin A下游引物序列为5’‑TTAACCCTTTAATGTGGCGGC‑3’(SEQ NO.2)，Ubiquitine上游引物序列为5’‑GCGGAATTCATGCAGATTTTCGTGAAAACCTTGAC(SEQ NO.3)，Ubiquitine下游引物序列为5’‑TAAAAGCTTTGCCACCGCGCAGGCGAAGGACC(SEQ NO.4)，Cecrop in A成熟肽基因上游引物序列为5’‑ACGAAGTTGTTGGGGATGGTTGAAAAAAATCGGCA(SEQ NO.5)，Cecrop in A成熟肽基因下游引物序列为5’‑CACTCGACTTAACCCTTTAATGTGGCGG(SEQ NO.6)。