[发明专利]一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法

摘要

本发明属于植物基因工程领域，公开发明了一种水稻中花11(Oryza sativa L.subsp.japonica)高效再生及转化体系建立的方法，其工艺过程包括诱导胚性愈伤组织的培养、胚性愈伤组织的继代增殖、根癌农杆菌介导的转化、胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养、筛选培养抗性愈伤组织、抗性愈伤组织的分化成苗。本发明工艺流程简单，生产成本低，可以显著提高中花11胚性愈伤组织的诱导率、继代增殖率和分化再生率，同时缩短获得再生水稻植株的周期；在此基础上，利用改进的根癌农杆菌介导法，可显著提高获得转基因水稻植株的效率，缩短获得转基因水稻植株的周期。

主权项

一种水稻中花11高效再生及转化体系建立的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)诱导胚性愈伤组织的培养：选取中花11种子，去壳，消毒后，接种于含2～3mg/L2，4‑D的诱导培养基上，30～34℃、持续光照培养，直至种子盾片处长出颗粒状胚性愈伤组织；(2)胚性愈伤组织的继代增殖：剥下由上述种子盾片处长出的颗粒状胚性愈伤组织，置于继代培养基上，进行继代培养，5～7天继代一次，继代1～2次；(3)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化：将含有目的基因重组质粒的根癌农杆菌菌种，划线于细菌固体培养基上进行活化培养，挑取上述根癌农杆菌单克隆菌落，加至AAI培养液中，培养温度28±1℃，摇菌，使根癌农杆菌菌液OD600＝0.05～0.1；选取步骤(2)继代培养中结构致密的胚性愈伤组织颗粒，在上述根癌农杆菌菌液中浸染4～7分钟，摇晃均匀；然后将浸染后的胚性愈伤组织在无菌条件下进行表面风干；(4)胚性愈伤组织与根癌农杆菌的共培养：在共培养基上添加一张用AAI培养液浸湿的无菌滤纸，然后将上述表面已风干的胚性愈伤组织转移至共培养基上，26℃、暗培养2～3天；(5)筛选培养抗性愈伤组织：将上述共培养后的胚性愈伤组织表面的根癌农杆菌漂洗干净后，在无菌条件下进行表面风干，再转接至含20～30mg/L抗生素的选择培养基上进行第一次筛选培养，培养10～14天后转移至40～50mg/L含同种抗生素的选择培养基上进行第二次筛选培养，培养20～30天后，即获得新鲜的抗性愈伤组织；所述筛选培养温度为30～34℃、持续光照；所述抗生素为表达载体上携带的植物抗生素抗性基因所编码的抗生素；(6)抗性愈伤组织的分化成苗：将抗性愈伤组织接至含6‑BA浓度为4～5mg/L、NAA浓度为0.2～1mg/L的分化培养基上，25～28℃、16小时光照/8小时黑暗交替，培养直至分化出绿苗；待苗长至2～4cm时移至生根培养基培养6～8天后移栽到大田。