[发明专利]通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法

摘要

本发明涉及通过敲除phrC基因提高枯草杆菌抗菌肽产量的方法，属于生物技术领域。本方法首先以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，以大肠杆菌克隆载体pGEM-T为骨架构建一个基因敲除载体pCSF-EM，利用同源重组原理，通过双交换过程敲除枯草芽孢杆菌ATCC9943基因组phrC基因的方法构建了一个高产抗菌肽菌株FMB25。经过高效液相色谱分析，确定改良菌株产surfactin和fengycin的能力大大提高。

主权项

通过敲除phrC基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法，其特征在于：（1）phrC基因敲除载体pCSF‑EM的构建设计引物PhrC5’‑F和PhrC5’‑R，以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分5’端phrC基因及其上游基因，获得500bp基因片段；设计引物PhrC3’‑F和PhrC3’‑R，以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增部分3’端PhrC基因及其下游基因，获得500bp基因片段；设计引物EM‑F和EM‑R，以pMUTIN4质粒为模板PCR扩增包括启动子和终止子的红霉素抗性基因表达框，获得850bp基因片段；扩增得到的三个基因分别克隆至pMD19‑T载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a，经验证、测序正确后，分别命名为pCSF5’‑T、pCSF3’ ‑T、pEM‑T，于‑20℃条件下保存备用；名称序列酶切位点PhrC5’‑F5’GAATTCCATGGCCCAAGCAGAACAAAAAGCC 3’EcoRIPhrC5’‑R5’TCTAGACATGAAAGTCGAGTGCTTCCGCAT 3’XbaIPhrC3’‑F5’AAATCTAGATAAGAACAAGCCCCTTCTCATTAG 3’XbaIPhrC3’‑R5’ACAGCATGCTTTATATCACCTTCATATAGCCG 3’SphIEM‑F5’ TGATCTAGATAGAAGCAAACTTAAGAGTGTGT 3’XbaIEM‑R5’ TGATCTAGAAATTATTTCCTCCCGTTAAATAAT 3’XbaIpCSF5’‑T用EcoRI/XbaI双酶切后获得phrC5’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM‑T载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM‑phrC5’载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pCSF3’‑T用XbaI/SphI双酶切后获得phrC3’片段，与经过相同双酶切处理的pGEM‑phrC5’载体，用T4 DNA连接酶连接，构建pGEM‑phrC载体，酶切验证正确后于‑20℃条件下保存备用；pEM‑T用XbaI酶切后获得EM片段，与经过相同酶切处理的pGEM‑phrC载体，用T4 DNA连接酶连接，构建phrC基因敲除载体pCSF‑EM，酶切验证正确后，转化大肠杆菌DH5a，用于下一步转化；（2）FMB 25突变菌株的构建以枯草芽孢杆菌ATCC 9943制备感受态细胞，采用电转化方法，将获得的phrC基因敲除载体pCSF‑EM转化入枯草芽孢杆菌ATCC 9943，在基因组phrC位点发生双交换，红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株，命名为FMB 25；该菌株的phrC基因被红霉素抗性基因所取代，成为缺失了phrC基因的突变菌株，即为所得到的菌株。