[发明专利]牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用

摘要

本发明涉及了一种牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体及其构建方法和应用。该方法以质粒pIRES2-EGFP为骨架载体，在多克隆位点Sal I与BamH I之间插入牛Nramp1开放阅读框序列，并用Nramp1基因表达调控序列替换掉骨架载体上巨细胞病毒(CMV)启动子序列，从而实现Nramp1基因在吞噬细胞内的特异性表达。本载体可以作为一种转基因载体应用在转基因抗病动物培育中。本发明还指出秦川牛Nramp1开放阅读框序列与GenBank中相应序列(GenBank序列号U12862.1)相似率为99.88％，存在两个碱基差异。

主权项

牛Nramp1巨噬细胞特异性表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：血液基因组提取：A2：Nramp1调控区序列的扩增，具体包括以下操作，A21：引物设计：从牛Nramp1全基因序列结合其核心启动子区序列设计含Vsp I和Xho I酶切位点的引物：F：5’‑CCATTAATCCCTCTACCCCTGCCTCTCC‑3’R：5’‑CCTCTCGAGGCGGTGGCGATTGTGC‑3’；下划线序列为酶切位点；A22：PCR反应：以荷斯坦奶牛外周血基因组为模板，按照TaKaRa公司TaKaRa TaqTM使用说明书进行PCR反应，反应程序如下：94℃3min；94℃30s，60.8℃30s，72℃2min 20s，30个循环；72℃10min；4℃10min；用1％琼脂糖凝胶电泳分离待回收的PCR产物，切胶回收；回收产物与pMD18‑T simple载体连接，转化DH5α感受态细菌进行蓝白斑筛选；挑取阳性菌落，提取质粒后用Vsp I及XhoI进行双酶切鉴定；酶切正确的质粒送样测序序列正确者命名为pMD18‑P；A3：吞噬细胞特异性表达载体pIRES2‑P的构建与鉴定：pMD18‑P与pIRES2‑EGFP载体分别用Vsp I及Xho I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2‑P；A4：牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体pIRES2‑PN的构建与鉴定pIRES2‑P与pMD18‑N4载体分别用BamH I和Sal I进行双酶切，胶回收获得的目的基因片段与相应载体片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细菌，选取阳性菌落增菌获得的重组质粒进行酶切鉴定，命名为pIRES2‑PN。