[发明专利]烟曲霉荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明涉及一种烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该检测方法是采用根据烟曲霉的线粒体翻译优化蛋白基因(Mitochondrial Translation Optimization Protein，Mto1)为参考序列，设计特异引物和探针，通过荧光定量PCR对烟曲霉进行定量分析。本发明建立了灵敏度高、特异性强、操作简单的烟曲霉荧光定量PCR检测方法，该方法速度快、高通量，能大大缩短检测周期，为疾病的治疗和疫情的控制提供保障，并能避免检测过程中可能造成的生物污染。

主权项

1.一种烟曲霉荧光定量PCR检测方法，其特征在于该检测方法包括以下步骤：(1)引物设计参照Mto1的基因序列设计特异性引物；(2)取备检样品提取病毒RNA；(3)PCR扩增PCR总体系为25μl，其中2×PCR Master Mix12.5μl，上、下游引物各1μl，模板1μl，余下用灭菌ddH₂O补足；反应条件为：95℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行30个循环，最后72℃延伸15min；反应结束后，取5μl PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳；(4)质粒标准阳性模板的制备①确定阳性质粒：PCR产物于1％琼脂凝胶中电泳后，用胶回收试剂盒提取DNA，将目的片段与pMD18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞中，于氨苄青霉素酶培养基37℃培养过夜，挑选转化长出的菌落进行单克隆培养，酶切鉴定挑取的阳性质粒，并通过序列测定进行分析，测定的序列与Genebank上的标准毒株序列对比分析，确定阳性质粒；②阳性质粒浓度的测定：将质粒提取物用超纯水10×稀释后，在260nm与280nm波长下测定液体中质粒的含量，并根据公式计算每微升液体中质粒DNA的拷贝数；注：每个碱基的平均分子量为660(5)荧光定量PCR标准曲线绘制提取上述阳性质粒DNA做荧光定量标准品，倍比稀释10⁷～10²copies/μL用于荧光定量PCR标准曲线绘制，扩增反应体系25μl，其中Mixl2.5μl，上下游引物各1μl，探针0.25μl，ROX0.5μl，模板5μl，超纯水4.7μl；反应条件为：50℃2min；95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环；通过倍比稀释质粒标准品进行灵敏度检测可知检测到最低浓度为100copies/reaction；(6)根据标准曲线分析被检材料中的烟曲酶。