[发明专利]多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法

摘要

本发明公开了多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，包括多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得，RACE法获得Hoxc10全长序列，采用DNASTAR软件和SWISS-PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10蛋白的抗原表位，选取优势表位肽段构建Hoxc10的原核表达载体，体外诱导融合蛋白表达，融合蛋白的纯化及多克隆抗体的制备等步骤。本发明以pGEX-4T1为基础所构建的体外Hoxc10表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步进行纯化，可方便地获得大量的GST-Hoxc10融合蛋白，经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎Hoxc10抗血清滴度高、特异性好。

主权项

一种多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法，其特征是：包括下列步骤：（1）多疣壁虎Hoxc10的EST序列的获得：根据同源比对小鼠、人、鸡物种Hoxc10基因序列，设计一对简并引物，序列如下：上游引物F: 5’‑TGTCTCTCAACACCTACCCATC‑3’; 下游引物R: 5’‑ GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT ‑3’ ,基因克隆获得多疣壁虎Hoxc10的EST序列；（2）多疣壁虎Hoxc10全长序列获得：RACE法获得多疣壁虎Hoxc10 的5’cDNA和3’cDNA 序列，与EST序列拼接后得到多疣壁虎Hoxc10全长序列，共包含2156bp,其ORF区位于112‑1242bp，共编码376个氨基酸；经生物学相关分析确认为多疣壁虎Hoxc10基因，GenBank登陆号：GQ267528.1；（3）使用DNA STAR软件和SWISS‑PLOT在线预测多疣壁虎Hoxc10抗原表位，选取96‑191片段为免疫肽段，对应397‑684核苷酸序列；（4）构建Hoxc10的原核表达载体：设计构建Hoxc10原核表达载体的引物，上游引物5’端加上XhoⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：5’‑ CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT‑3’;下游引物在其5’端加上EcoRⅠ酶切位点及其保护碱基和补充碱基使其不出现移码，序列为：5’‑ CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC‑3’；取多疣壁虎脑及脊髓组织，用Trizol试剂法提取总RNA； RT‑PCR扩增：用QIAGEN公司逆转录试剂盒及2μg总RNA进行逆转录反应，合成cDNA；采用原核表达引物，以合成的cDNA为模板进行多疣壁虎Hoxc10 的对应蛋白表位优势肽段96‑191的397‑684核苷酸序列， PCR扩增；用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ消化Hoxc10的PCR产物和pGEX‑4T1原核表达载体质粒，并进行酶切产物的胶回收；连接：用T4 DNA连接酶将PCR酶切回收产物和pGEX‑4T1原核表达载体质粒的酶切回收产物连接；感受态细胞的制备：用无菌接种棒从‑70℃保存的DH5α菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素LB琼脂板，37℃培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，置细菌培养摇床中于37℃、250转/分震荡培养12小时；取0.5ml该菌液接种于无氨苄青霉素100ml LB液体培养基中，37℃震荡培养2‑2.5小时，至OD600为0.4‑0.5时，放置于4℃冰箱冷却1‑2小时；将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30分钟；4℃离心，4000g×10分钟，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2‑甘油溶液1ml悬浮；以100μl/管分装入1.5ml离心管中，‑70℃冻存备用；重组质粒的转化：取5μl DNA连接产物加入100μl感受态细胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴30分钟，42℃水浴中热休克90秒，继续冰浴2‑3分钟后加入LB培养基200μl，于37℃摇孵育60分钟，将培养物涂于含氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12‑16小时；重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养板中挑取6个克隆接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，以碱裂解法小量提取质粒DNA，限制性内切酶消化1小时，电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中；将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定，其测序结果序列与基因库中397‑684核苷酸序列完全一致：1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG；（5）目的蛋白的表达：制备BL21感受态细胞；用鉴定正确的pGEX‑4T1‑Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞，挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素 50mg/L 的2ml LB培养基中37℃震荡培养过夜；将1ml菌液加入到含50ml LB培养基的1000ml培养瓶中，37℃震荡培养至OD600为0.6，取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下菌液中加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时；同时以转化了pGEX‑4T1载体的BL21细菌作阴性对照；将诱导、末诱导的含pGEX‑4T1载体的BL21菌液各1ml，室温10000g离心1分钟，弃去上清，0.01M PBS 500ml重悬，加入等体积 2 × SDS电泳上样缓冲液，100℃煮沸5分钟，然后以12000g离心1分钟，在12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20μl悬液，电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后检测融合蛋白表达情况；（6）目的蛋白的纯化：证实有目的蛋白表达后，将20ml转化了pGEX‑4T1‑Hoxc10的BL21细菌接种到1000ml LB培养基中进行扩大培养，37℃震荡培养至OD600为0.6，加入异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷至终浓度为0. 2 mmol/L，30℃诱导6小时，菌液离心，超声破碎后，用GE healthcare公司的glutathione sepharose吸附GST‑Hoxc10融合蛋白；用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose，将洗脱液放入预处理的透析袋中，夹紧，放入去离子水中，4℃透析24小时，收集透析后的液体；用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗脱、透析后的GST‑Hoxc10融合蛋白；（7）多克隆抗体的制备：参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书，定量透析后蛋白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫：第一次免疫，每只兔子用1 mg融合蛋白，加入等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全，于皮下多点免疫；第一次免疫24天后进行第二次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第一次免疫42天后进行第三次免疫，使用0.5mg融合蛋白与等体积的Freud’s不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫；第三次免疫10天后，Elisa检测Hoxc10抗血清达到效价后，心脏取血，免疫血清储存于‑80℃备用；使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中的Hoxc10蛋白进行检测，确定抗血清的特异性，并用于多克隆抗体的纯化。