[发明专利]一种增殖甲型流感病毒的方法

摘要

本发明属于动物传染病技术领域，具体涉及一种甲型H1流感病毒的分离鉴定及该病毒在MDCK细胞上稳定增殖的方法。本发明通过分离鉴定得到一株甲型H1流感病毒A-Influ/JML-F9，其保藏编号为CCTCC NO：V201105。通过优选方法、培养基及培养条件将该甲型H1流感病毒在MDCK细胞上的稳定增殖，大规模增殖该病毒的平均血凝效价达到7log2，其最高血凝效价达到9log2。

主权项

1.一种增殖甲型流感病毒的方法，其步骤包括：1)将疑似猪流感感染的气管拭子样品接种含有2μg/mL的TPCK-胰酶的细胞维持液分离病毒并进行判定；2)对步骤1)判定的血凝阳性样品用H1亚型猪流感的通用引物M684和甲型H1流感的通用引物H1-292进行RT-PCR扩增，进行流感病毒亚型鉴定，其步骤如下：反转录用的引物Uni12：其核苷酸序列(单链)如下：5’-AGCAAAAGCAGG-3’；流感病毒cDNA合成：在20μL反转录体系中进行，依次加入以下组分：将上述组分混匀后置PCR仪中，42℃60min，95℃5min进行反转录，反应产物直接用于PCR反应；其中：PCR反应的引物序列如下：M-684和H1-292M-684U：CAAGACCAATCCTGTCACCTC；M-684L：AAGACGATCAAGAATCCACAA，扩增得到的片段长度为684bp；H1-292U：CATTAATGATAAAGG；H1-292L：TCCAGCATTTCTTTC，扩增得到的片段长度为292bp；PCR反应体系：在25μL反应体系中进行，依次加入以下组分：PCR反应参数：M684：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；H1-292：95℃5min；94℃30s，42.5℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min；将PCR产物纯化后连接pMD18-T载体，选取阳性病料克隆M684和H1-292测序，判定是否为甲型 H1流感病毒；3)对甲型H1流感病毒进行全基因组测序，其步骤如下：以步骤2)所述的cDNA为模板，扩增甲型H1流感病毒8个基因HA，M，NA，NP，NS，PA，PB1和PB2，得到如序列表SEQ ID NO：1-8所示的核苷酸序列，其中扩增上述8个基因的特异引物的核苷酸序列如下所示：扩增HA基因：P15’AGCAAAAGCAGGGG 3’，P25’AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’；扩增M基因：P15’AGCAAAAGCAGGTAG 3’，P25’AGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3’；扩增NA基因：P15’AGCAAAAGCAGGAGT 3’P25’AGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3’；扩增NP基因：P15’AGCAAAAGCAGGGTA 3’，P25’AGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3’；扩增NS基因：P15’GCAAAAGCAGGGTG 3’，P25’AGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3’；扩增PA基因：P15’AGCAAAAGCAGGTAC 3’，P25’AGTAGAAACAAGGTACTT 3’；扩增PB1基因：P15’AGCAAAAGCAGGCA 3’，P25’AGTAGAAACAAGGCATTT 3’；扩增PB2基因：P15’AGCAAAAGCAGGTC 3’，P25’AGTAGAAACAAGGTCGTTT 3’；按步骤2)的方法提取甲型H1流感病毒RNA，合成甲型H1流感病毒cDNA；甲型H1流感病毒cDNA的PCR扩增：在PCR反应管中加入反转录产物2.0μL，LA TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，10×LA Taq DNA Buffer5μL，dNTPs Mixture(各2mM)2.0μL，上述8个基因的正向引物和反向引物各2.0μL，用ddH₂O调终体积至50μL，混匀后于PCR仪上进行扩增；PCR扩增程序：预变性95℃5min，变性94℃30sec，退火52℃30sec，延伸72℃4min，运行35个循 环后于72℃延伸10min。对PCR产物进行回收，连接pMD18-T载体，转化后进行菌液PCR鉴定，将判定为阳性的样品进行测序；4)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-1～10^-3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，弃去细胞生长液，换上细胞维持液；5)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，接种12孔板的MDCK细胞，在细胞维持液分别加入终浓度为0～4μg/mL的TPCK胰酶；6)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL，接种于12孔板的MDCK细胞，然后分别加入pH为7.0～8.0的细胞维持液，观察细胞病变；7)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL；在pH＝7.6的条件下，用表面积为160cm²的800mL的细胞瓶进行甲型H1亚型病毒增殖；8)将HA效价为8log₂的甲型H1亚型流感病毒以10^-3稀释，加入TPCK胰酶使终浓度为2μg/mL；在pH＝7.6的条件下，用表面积为2350cm²的10L的转瓶进行甲型H1亚型病毒增殖；其中步骤1)和4)所述的细胞维持液配方如下：先取DMEM粉剂一小包，再取HEPES，FREE ACID 4.77g，NaHCO₃7.4g，溶于ddH₂O中，待完全溶解后再用ddH₂O定容至1L，最后用2M的NaOH调溶液的pH至7.4，无菌过滤后储存于4℃条件下备用；其中步骤4)所述的细胞生长液配方如下：在细胞维持液中按V/V计加入10％的灭活新生牛血清。