[发明专利]一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法

摘要

本发明公开了一种使用人工染色体构建转基因斑马鱼的技术及其辅助质粒。本专利使用这一技术构建了蓝色荧光转换黄色荧光的心血管系统转基因系。步骤包括：1）特异性人工染色体获得及目的基因的构建2）人工染色体重组插入目的基因3）重组的人工染色体导入斑马鱼受精卵4）阳性转基因系筛选。本技术发明是一种具有国际领先水平的细菌人工染色体重组工程技术，极大的提高了转基因构建效率，将为我国生物医学基础研究和药物研究提供有力的工具。

主权项

一种使用人工染色体重组技术培育心血管系统荧光转换斑马鱼的方法，其特征在如下步骤实现：A、flk BAC导入工程菌SW105，其中flk BAC为CH211‑231B5；B、采用目的片段5’引物 ：5’‑CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT‑3’  和目的片段3’引物 ：5’‑ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCAGAGTAGTGAGGAG‑3’ 扩增pPCRBloxYkanFrt中的荧光转换基因元件；C、荧光转换基因元件的电击导入含flk‑BAC感受态细胞，并大量培养；D、清除插入基因片段所带筛选抗性；E、引入Tol/ISceI转座位点提高整合效率：其中Tol/ISceI插入位点1引物:上游引物：5‘‑ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC‑3’下游引物：5‘‑GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC‑3’Tol/ISceI插入位点2引物:上游引物：5‘‑GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG‑3’下游引物：5‘‑CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC‑3’；F、斑马鱼胚胎的注射；G、潜在的成功转基因鱼筛选。