[发明专利]运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法

摘要

本发明涉及使用PCR扩增技术检测禾草腥黑粉菌(TilletiafuscaEⅡ&EⅤ)和雀麦腥黑粉菌[T.bromi(Brockm.)Brockm]的方法，属于禾本科草种腥黑粉菌检测领域。本发明设计了6套引物，即通用外套引物、通用内套引物、T.fusca的外套引物和特异引物、T.bromi的外套引物和特异引物。通用外套引物用于菌丝基因组DNA或冬孢子的套式扩增，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，这两套引物用于扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性。T.fusca和T.bromi的外套引物和特异引物可用于两种菌的菌丝基因组DNA双重特异PCR扩增，各自的外套引物与特异引物用于双重套式PCR特异扩增冬孢子DNA。

主权项

一种运用双重PCR引物检测禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌的方法，既能对菌丝基因组DNA实现双重特异PCR检测，又能对冬孢子实现双重套式PCR检测，其特征在于，所设计的引物和用途如下：（1）设计腥黑粉菌属通用引物，序列如下：通用外套引物：IGSUF1：GGA TGC ATT CTG GGG ACG TIGSUR1：GTA GCC TTG TTG CTA CGA TCT G 通用内套引物：NIGSUF1：CAC CGC CCA AGC ACG TACNIGSUR1：GAC CTT TTG GGG TCA AAC TTC TC通用外套引物用于腥黑粉菌属菌丝基因组DNA或冬孢子套式扩增，扩增片段约为900bp，通用内套引物用于冬孢子的套式扩增，扩增片段约为700bp，这两套引物用于腥黑粉菌属扩增过程质量监测，检查所抽提的菌丝基因组DNA质量和冬孢子的挑取和破碎，避免检测过程中的假阴性；（2）设计禾草腥黑粉菌和雀麦腥黑粉菌各自的外套引物和特异引物，序列如下：禾草腥黑粉菌的外套引物：IGSUF2：GAG CGA TAC CTT TGC ATT CTG ACG TIGSUR2：CAC TGC ATT CTG GGG ACG TAC禾草腥黑粉菌的特异引物：PFSF：GAC TCG CGT CAA GCG APFSR：GCG AAG GGA AAG TTC GAC，特异引物的扩增片段约为140bp，这两套引物用于禾草腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增，雀麦腥黑粉菌外套引物：tubF：GAA GAC GTA TGC GTT GAG GAtubR：AGG AGG ATG CCG AGC GAG A雀麦腥黑粉菌特异引物：PNSF：CTC AAC CCT TCC CTC TAT TCCPNSR：CGA TAC GGA TTC TGC ATT CC特异引物的扩增片段约为420bp，这两套引物用于雀麦腥黑粉菌的菌丝基因组DNA特异PCR扩增和冬孢子套式PCR的扩增。