[发明专利]免疫七肽的制备方法

摘要

本发明属于多肽的制备领域，具体而言，本发明涉及免疫七肽GQTYTSG的制备方法。

主权项

制备免疫七肽的方法，其依次包括以下步骤：(1)制备Fmoc‑Gly‑树脂称取2‑氯‑三苯氯甲基树脂N克加注入反应柱中，加入10Nml DCM，室温浸泡30分钟后用真空泵抽干，加入Fmoc‑Gly‑OH  0.3Ng、DIEA 0.8Nml、和DCM 8Nml，室温反应1.5小时，再加入封闭试剂甲醇Nml室温反应0.5小时，树脂依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gly‑树脂；   (2)制备Fmoc‑Ser（tBu）‑Gly‑树脂    在步骤(1)的Fmoc‑Gly‑树脂中，加入8Nml脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Ser(tBu)‑OH 0.64Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml于室温反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；所述脱帽试剂为20%哌啶的DMF溶液v/v；(3)制备Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂    在步骤(2)的Fmoc‑Ser（tBu）‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Thr(tBu)‑OH 0.5Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(4)制备Fmoc‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂在步骤(3)的Fmoc‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Tyr(tBu)‑OH 0.8Ng、DIEA0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(5)制备Fmoc‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂    在步骤(4)的Fmoc‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑ Thr(tBu)‑OH 0.5Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(6)制备Fmoc‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂在步骤(5)的Fmoc‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Gln(Trt)‑OH 1.4Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(7)制备Fmoc‑Gly‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂在步骤(6)的Fmoc‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，加入Fmoc‑Gly‑OH 0.52Ng、DIEA 0.4Nml、TBTU 0.56Ng、HoBT 0.94Ng、和DMF10Nml反应1.5小时，用真空泵抽干，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，抽干，获得Fmoc‑Gly‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(8)制备Gly‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂在步骤(7)的Fmoc‑Gly ‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂中，加入8Nml上述脱帽试剂，室温反应5分钟，抽干，重新加入8Nml该脱帽试剂室温反应20分钟，依次用DMF洗涤3次，异丙醇洗涤3次，重蒸过的DMF洗涤2次，甲醇洗涤2次，用甲醇浸泡0.5~3小时，抽干，用氮气吹干树脂颗粒，所得到的树脂为Gly‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂；(9)免疫七肽粗产品的获得把吹干的Gly‑Gln(Trt)‑Thr(tBu)‑Tyr(tBu)‑Thr(tBu)‑Ser(tBu)‑Gly‑树脂倒入玻璃的切割瓶中，加入预冷至‑20~10℃的切肽试剂，冰浴反应1.5小时，过滤除去树脂，加冰乙醚500ml沉淀，3500转3分钟离心收集沉淀物，用乙醚洗涤1~6次，用纯水溶解后，低温冷冻干燥24小时，获得免疫七肽粗品；所述切肽试剂由TFA 9.5Nml、EDT 0.25Nml、和H2O 0.25Nml组成;Gly  glycine    甘氨酸            Gln  glutamine  谷氨酰胺      Thr  threonine  苏氨酸         Tyr   tyrosine   酪氨酸         Ser   serine    丝氨酸       tBu  叔丁基Trt   三苯甲基Fmoc     芴甲氧羰酰基DCM     二氯甲烷DMF      二甲基甲酰胺DIEA     N,N‑二异丙基乙胺HBTU    苯并三氮唑•N,N,N`,N`,‑四甲基脲六氟磷酸酯HOAt     N•羟基‑7‑偶氮苯并三氮唑TFA       三氟乙酸EDT       乙二硫醇。