[发明专利]山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法

摘要

本发明涉及一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，利用皮肤成纤维细胞外基质诱导和机械分离与酶消化相结合的方法，启动了ORSC的原代培养，并利用不同培养液，成功建立了山羊毛囊外根鞘细胞系。利用本发明构建的山羊毛囊外根鞘细胞系已稳定传至第40代以上，且生长分裂状态良好。本发明不仅可为阐明毛囊的生长发育规律、影响因素及其调控机制提供研究模型；为提高山羊毛产量和羊绒品质的育种改良奠定基础；还可为提高羊毛品质、数量和毛皮花纹品质乃至医学领域的人类毛发再生研究等奠定基础。

主权项

一种山羊毛囊外根鞘细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：a、活体采集1~3日龄济宁青山羊体侧偏背部皮肤0.5cm×0.5cm大小的含完整毛囊的皮肤组织样，将皮肤组织样用碘酒和酒精消毒，再用生理盐水洗净酒精后迅速放入无血清DMEM/F12培养液，于冰盒中带回实验室，在12h内进行分离培养；b、预先采用组织块贴壁方法，分离并培养山羊皮肤成纤维细胞于6孔细胞培养板中，待细胞生长至会合时，除去所述无血清培养液，按每孔3mL量加入含1% Triton X‑100溶液，37℃孵育30min后，去除Triton X‑100溶液，用无菌超纯水冲洗干净，置于4℃下备用；c、将皮肤组织样经无菌化处理剪成组织悬液，利用Dispase酶分离皮肤表、真皮层后拔出毛囊，采用组织培养与消化培养相结合的方法，将游离毛囊进行胰蛋白酶消化处理后接种于上述6孔细胞培养板中，每孔加入3mL量含10ng/mL EGF、10ng/mL IGF‑I、0.4μg/mL氢化可的松和10%FBS的DMEM/F12完全培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度条件下进行培养；约4—5天待毛囊周围迁移出大量细胞后，更换为等量含10ng/mL IGF‑I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液，在37℃，5%CO2浓度饱和湿度培养箱中启动原代培养；待游离出的毛囊外根鞘细胞生长成单层后，消化移入培养瓶中，按照每瓶10mL量加入含10ng/mL IGF‑I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松的无血清角质细胞培养液进行培养，每2~3天更换一次工作培养液；d、当毛囊外根鞘细胞生长至会合状态后，进行传代；待ORSC稳定生长至8~10代时，更换成10mL含10ng/mL IGF‑I、10ng/mL EGF、0.4μg/mL 氢化可的松和2%FBS的DMEM/F12维持培养液进行培养，以利于外根鞘细胞在体外长期传代；e、选择对数生长期细胞，利用传代培养的方法制成细胞悬液，然后加入含10% DMSO和30% FBS的DMEM/F12冻存培养液并分装入无菌冻存管中，封口，标记；将冻存管依次置于4℃1h、‑20℃1h、‑70℃12h，最后移入液氮中长期保存细胞；复苏细胞时，用40℃温水快速解冻细胞，按5×105个/mL的细胞密度接种于培养瓶。