[发明专利]一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法

摘要

本发明涉及一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法。该方法主要步骤是：取苗期鲜叶样采用CTAB法提取基因组DNA，以基因组DNA作为扩增模板结合特异引物进行PCR反应，然后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统中观察、读取分子标记带谱，再与目标带谱进行对比来判定样品的转化特性。本发明所述的方法不受环境因素影响，也无需人工化学诱导烟碱转化，苗期即可取样操作，将转化株的鉴定与筛选提前到烟苗移栽前，大大节省了时间，而且精准高效、操作简便、易于推广，可用于烟草亲本种子提纯，种子烟碱转化性状鉴定，也可适应于其他烟草类型烟碱转化株的鉴定与剔除。

主权项

一种烟草烟碱转化株苗期的分子生物学鉴定方法，其特征在于具体步骤依次如下：A、对需鉴定的烟苗逐个挂牌以标识，然后于苗期对每个被标识的烟苗进行鲜叶取样，每个烟苗取样量为1‑2个叶片，取好的鲜叶样品用密封袋装好，并做好与原烟苗一致的标识，迅速放入冰盒或超低温冰箱中保存；B、提取基因组DNA：取出每个密封袋中的鲜叶样品，采用CTAB法提取各样品烟苗基因组DNA，纯化后保存备用；C、对基因组DNA进行PCR反应：用紫外分光光度计测定B步骤中提取的烟苗基因组DNA的浓度，然后取各样品烟苗基因组DNA溶液，将其浓度稀释成50ng/μL作为反应模板进行PCR反应，PCR反应中的特异引物序列：正向引物：5’‑ATGGTTTTTCCCATAGAAGCC‑3’，反向引物：5’‑TCGAGGTCGACGGTATC‑3’；D、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及电泳结果的读取：将步骤C中所获得的PCR产物与溴酚蓝‑甘油溶液以4∶1的体积比混合，注入样品槽，同时注入对照ladder进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，清除表面的溴化乙锭溶液，然后将胶板放入凝胶成像仪的观察板上，利用电脑成像系统在波长254nm紫外灯下进行观察，拍照记录下电泳图谱，并保存以进行比较分析；E、转化株的鉴定与淘汰：将通过PCR特异引物扩增已知高转化株所获得的分子带谱数值作为比较分析的参照数据，其具体数值的大小介于1700‑1800bp之间；将步骤D中样品PCR扩增所得的分子带谱与两边对照ladder带谱进行对比，其中能扩增出分子带谱且带谱数值大小介于1700‑1800bp之间的样品为高转化株，有分子带谱但大小小于1700bp的样品为中等转化株，淘汰高转化株和中等转化株；无法扩增出分子带谱或者带谱信号微弱的样品为非转化株烟苗，保留备用。