[发明专利]大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法

摘要

大青杨转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法，它涉及转基因体系建立及其转基因植株的扩繁方法。体系建立：获得组培苗；含有LbDREB基因的工程菌的活化及外源基因的转化；脱菌后获得抗性芽；抗性芽生根及移栽；再生植株进行PCR和RT-PCR检测，选取阳性植株，即完成。扩繁：大青杨转基因体系建立所获得的大青杨转基因再生植株进行分化培养，获得组培苗；进行PCR和RT-PCR检测，取阳性的根、茎段和叶片；三、重复操作2次，即完成。本发明可实现转基因大青杨的快速培育，为大青杨优良品种的开发奠定基础；产生的后代遗传稳定性好，对于实现大青杨转基因苗木的大规模、短周期、高繁殖率和低成本的工厂化生产有重要意义。

主权项

大青杨转基因体系建立的方法，其特征在于大青杨转基因体系建立的方法按以下步骤实现：一、将一年生大青杨叶片和茎段在超净工作台内用体积浓度为70％的酒精浸泡30s～1min，灭菌水冲洗2～3遍，然后转入质量浓度为1％的NaClO溶液中消毒10～20min，灭菌水冲洗3～5遍，再接种到含0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上培养一个月，获得组培苗；二、挑取一个含有LbDREB基因的工程菌的单菌落接种到20ml的LB培养基上培养至菌液的OD600值为0.5～1.0，然后用移液枪吸3～5ml的菌液至离心管中，以12000r/min的转速离心1min，弃上清后加入等体积的1/2MS培养基并混匀，获得侵染液，然后倒入培养皿中，再取组培苗的形态学上端的第二、第三叶片和形态学上端的三个茎节置于培养皿中，将叶片边缘切去后切成0.5×0.5cm的块，并在叶脉处横切2～3刀，茎节切去两边，侵染30min后取出叶片和茎节接种到含0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基上暗培养2天，然后用灭菌水冲洗3～5遍，再放入含200mg/L头孢霉素的1/2MS培养基中，置于128r/min摇床上摇20～30min，取出后用灭过菌的滤纸吸干，即完成叶片和茎节的脱菌；三、脱菌后叶片和茎节接种到含50mg/L卡那霉素、200mg/L头孢霉素、0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中暗培养至愈伤组织或不定芽形成，然后移至光下并在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40μmol·m‑2·s‑1、每天光照16h的条件下培养1～2个月，获得抗性芽；四、将抗性芽接种到含0.1mg/L 6‑苄氨基嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中培养至抗性芽高于3cm，然后转接于含20g/L蔗糖和5g/L琼脂的1/2MS培养基中进行生根培养，再挑选根系发达的植株移栽到栽培基质中，浇透水并覆盖塑料膜，在温度为25℃、湿度为70％、光照强度为40～100μmol·m‑2·s‑1、每天光照16h的条件下培养6天后去掉覆盖的塑料膜，获得再生植株；五、取再生植株的叶片，用CTAB法提取基因组DNA，以含LbDREB基因的质粒DNA做阳性对照，未转化植株DNA及ddH2O做阴性对照，进行PCR扩增，选取阳性的大青杨转基因再生植株，再用改良SDS法提取阳性的大青杨转基因再生植株的RNA，进行RT‑PCR检测，选取阳性的大青杨转基因再生植株，即完成大青杨转基因体系建立。