[发明专利]具有潜在抗猪瘟病毒作用的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建

摘要

本发明涉及一种具有潜在抗猪瘟病毒特性的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：包括以下的步骤：(1)基因片段的获得；(2)载体的构建；(3)稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选；(4)检测报告基因的表达；本发明能够用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该蛋白基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。

主权项

一种抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：包括以下的步骤：(1)基因片段的获得；(2)载体的构建；(3)稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选；(4)检测报告基因的表达；所述的基因片段的获得，首先是采集猪瘟病毒感染猪的静脉血，用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，抽提细胞总RNA并反转录，然后根据NCBI数据库中公布的IRG6序列为模板，扩增出包含IRG6开放阅读框ORF的IRG6‑KZ大片段；所述的载体构建是以IRG6‑KZ和PCDNA‑GFP质粒为模板分别设计两对含有酶切位点的引物，扩增出IRG6‑E和GFP‑E，并运用双酶切、T4连接酶将GFP和IRG6分别亚克隆到PCDNA3.1载体上；所述的双酶分别为核酸内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ；所述的IRG6稳定表达细胞系的筛选是将构建好的真核表达质粒转染PK‑15细胞，继续培养转染质粒的细胞24小时后进行细胞传代，并使用终浓度为1000‑1600μg/ml的G418筛选，以终浓度为400‑800μg/ml G418为维持筛选浓度，连续筛选约14天后，挑单个克隆细胞株进行扩大培养，获得IRG6蛋白与GFP稳定表达的细胞系，通过RT‑PCR检测到IRG6‑GFP嵌合基因。