[发明专利]耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法

摘要

本发明公开了耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法，包括以下步骤：步骤A1，前体α-淀粉酶基因的扩增：步骤A2，前体α-淀粉酶的的定点突变；步骤A3，突变α-淀粉酶表达载体的构建；步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌。应用本发明获得的重组体菌株可以进行耐酸性α-淀粉酶突变体的工业化生产，在有选择压力的液体培养基中培养重组体细胞，无需经诱导表达，上清用硫酸铵沉淀，沉淀透析除盐之后加入丙烯葡聚糖凝胶S300凝胶柱，用洗脱液洗脱即可得到所需的耐酸α-淀粉酶突变体。

主权项

耐酸中温α‑淀粉酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤A1，前体α‑淀粉酶基因的扩增：提取枯草芽孢杆菌染色体DNA，根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌淀粉酶基因为依据，设计如下引物：上游引物F1：5’‑GCGCGAATTCGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG‑3’(SEQ ID NO：1)下游引物R1：5’‑CGCGAAGCTTATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG‑3’(SEQ ID NO：2)；PCR产物经纯化、双酶切后，连接到同样经双酶切线性化的pET‑22b，转化大肠杆菌JM109，得到pET22‑ACN7；步骤A2，前体α‑淀粉酶的的定点突变：设计含突变氨基酸残基的互补引物如下：引物1：5’‑TTGGTCGGACGGATGGGACATCACT‑3’(SEQ ID NO：4)引物2：5’‑AGTGATGTCCCATCCGTCCGACCAA‑3’(SEQ ID NO：5)引物3：5’‑GGGCCATAGAAGATACCGGATCATG‑3’(SEQ ID NO：6)引物4：5’‑CATGATCCGGTATCTTCTATGGCCC‑3’(SEQ ID NO：7)以重组质粒pET22‑ACN7为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在薄壁离心管内混合：PCR1：采用50μL体系，ddH2O38.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物1(20μmol/L)2μL，引物2(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL。扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。PCR2：采用50μL体系，ddH2O38.5Ml，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物3(20μmol/L)2μL，引物4(20μmol/L)2μL，DNA模板1μL，pfu高保真DNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，60℃，40s，72℃，2min，20个循环；最后1个循环为72℃7min。PCR产物经纯化、转化大肠杆菌XL‑10感受态细胞，挑选阳性克隆，经过测序验证，最终得到含有突变α‑淀粉酶基因的重组表达载体pET‑ACN7‑2；步骤A3，突变α‑淀粉酶表达载体的构建：枯草芽孢杆菌表达载体采用pWB980，设计如下引物：上游引物F2：5’‑CGCGGATCCAGGAAACTGCAAACAAATCGAATGAGGTG‑3’(SEQ ID NO：9)；下游引物R2：5’‑CGCGGCATGCATGCGGAAGATAACCATTCAAACCGG‑3’(SEQ ID NO：10)；以重组表达载体pETCN7‑2为模板进行PCR扩增，按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合：采用50μL扩增体系：ddH2O 41.5μL，10×buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)1μL，上下游引物2(20μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL.扩增条件为：94℃2min，1个循环；94℃40s，58℃，40s，72℃，2min，30个循环；最后1个循环为72℃10min；将所得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测、纯化、双酶切，然后连接到同样双酶切线性化的pWB980载体上：在1.5mL离心管中加入12μL纯化的DNA，4μL线性pWB980载体，2μL 10×连接酶buffer，1μL T4 DNA连接酶，加水至总体积为20μL，16℃连接过夜；步骤A4，表达载体转化枯草芽孢杆菌，将步骤A3的连接混合物转化枯草芽孢杆菌WB600的感受态细胞，枯草芽孢杆菌转化子提取质粒，提取的质粒用限制性内切酶BamH I和Sph I进行酶切鉴定，测序，构建了枯草芽孢杆菌重组表达载体pWB980‑ACN7‑2。