[发明专利]一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法

摘要

本发明涉及一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，由多路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理两大部分构成，采用关键部件--集成式电控液晶全息透镜阵列实现多路共焦调频，通过多路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经由采集信号处理部分中的光纤及光纤耦合器组，经功率放大电路，再通过数据采集卡进行模数转换，经过对信号的傅里叶变换频谱信息，滤波，解调过程还原每个荧光点处发出的荧光信号随时间的强度变化，从而实现多点并行高分辨探测。具有横向分辨率、纵向分辨率、时间分辨率高的特点，并且实现了多点并行实时探测，具有便捷和实用的应用特点。

主权项

一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）搭建四通道多频调制激光光路：将准直半导体激光器（1）发出的光束耦合进扩束镜（2），扩束镜（2）出射的光束到达2×2式H‑PDLC透镜阵列（3）上进行分光和四个不同频率的斩波调制输出，并调节后端透镜阵列（4），使得透过透镜阵列的一级衍射光束聚焦，确定透镜阵列（4）的焦平面位置F；2）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的荧光激发部分光路：将从透镜阵列出射的聚焦的四束光调整为平行光束射出，经过镜面（5）耦合进入二向色镜组（6）中，经二向色镜组（6）激发的激光将耦合垂直入射无限远油浸显微物镜（7），将生物样品（8）摆放于三维调整架之上，调整三维调整架的旋钮以改变生物样品（8）与显微物镜（7）间的距离，使样品（8）恰好处于显微物镜（7）焦平面上，光束将在物镜的作用下在生物样品（8）上聚焦为四个光点，激发出荧光；3）搭建四路频分复用荧光共焦显微镜的显微成像：由生物样品（8）表面激发的荧光在样品与显微物镜相互垂直的条件下将与激发光沿同一直线，反向通过显微物镜（7），成为平行光束，达到二向色镜组（6），荧光全部从二向色镜（6）透射出去，将这束荧光入射分光棱镜BS（9）进行第二次分光，得到特性相同的两部分，其中一部分由消色差透镜（10）会聚，并将CCD摄像机（11）放置于透镜（10）的焦平面上，探测荧光光束信号，在电脑显示屏上显示观察生物样品的显微成像；同时使从分光棱镜BS（9）的另一个表面出射的荧光经光纤耦合器组耦合进入光纤阵列（14）相当于共焦小孔的作用后，通过光纤（15）输送到光电倍增管PMT（16）中；4）信号采集与处理部分的实现：光电倍增管PMT（16）将根据生物样品中激发得到的四个荧光点处的荧光强度的大小，将荧光点处的图像信号，通过光电转换，以电信号的形式输出，将光电倍增管PMT（16）的输出端接电压放大电路（17），将PMT（16）采集到的微弱信号进行电压放大，再将电压放大电路的输出接入数据采集卡，最后由USB接口将信号数据送入计算机（18），通过Matlab软件，编写程序，将调制荧光信号通过滤波器滤去高次谐波和部分噪音，并将经过调制的荧光信号相分离，按各自的调制频率进行解调后获取原始荧光信号，得到所需的样品信息。