[发明专利]一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法

摘要

本发明公开了一种雌性生殖干细胞的体外分离及培养方法，从雌性哺乳动物的卵巢的生殖上皮得到细胞，雌性生殖干细胞的分离纯化方法采用0.2％明胶和Matrigel差速贴壁结合克隆法，将未贴壁的雌性生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、分离。分离到的雌性性生殖干细胞培养在MEF饲养层上。分离到的雌性生殖干细胞具有ES细胞特性和向肌肉细胞、脂肪细胞和卵母细胞样细胞以及三个胚层在内的多种细胞的分化潜能。

主权项

一种雌性生殖干细胞的体外分离方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离细胞将从无菌采集的卵巢中分离的卵巢生殖上皮剪碎至碎块，用包含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬2～3次，静置之后得到下层的组织团；然后用包含质量分数0.1％的Collagenase I、10μg/ml DNase和质量分数0.1％透明质酸酶的混合液消化处理组织团2～3次，每次20～30分钟，再用包含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液重悬，分离得到卵巢源生殖细胞；2)雌性生殖干细胞的原代培养将得到的卵巢源生殖细胞以2×105个/mL的密度接种在经质量分数0.2％的明胶37℃包被30min的塑料培养皿，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；所述雌性生殖干细胞分离培养液以DMEM/F12培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积分数20％的胎牛血清与血清替代品(KSR)当中的一种、2mmol/L L‑谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、0.1mmol/Lβ‑巯基乙醇、0.1mmol/L非必需氨基酸、5～10ng/mL的碱性成纤维生长因子、2.5μmol/L BIO(6‑bromoindirubin‑30‑oxime)、100IU/ml青霉素和100mg/mL链霉素；培养12h后将未贴壁的细胞转到经Matrigel基质膜4℃包被1h的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；未贴壁的细胞第一次转移培养12h后，将转移培养后再次未贴壁的细胞转移培养到经Matrigel基质膜4℃包被1h的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；未贴壁细胞第二次转移培养后，2d更换1次培养液；细胞生长3～7d后，开始出现致密胚胎干细胞样集落；3)雌性生殖干细胞的传代培养待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时，将致密胚胎干细胞样集落吸出，在PBS中洗涤2次；再移到TrypLE细胞消化液或质量分数0.05％的胰蛋白酶中消化2～3min，并吹吸5～20次；将离散开的单细胞或小细胞团转移到经Matrigel基质膜4℃包被1～2h的塑料培养皿培养，培养液为雌性生殖干细胞分离培养液；37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养；培养3～7d后，开始出现致密胚胎干细胞样集落，即为雌性生殖干细胞。