[发明专利]乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

摘要

本发明公开了乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。本试剂盒包括荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR??Buffer、含有Mg2+离子的溶液、rt204位点正向引物、rt204位点反向引物、rt204M位点探针、rt204I位点探针、rt204V位点探针、rt180位点正向引物、rt180位点反向引物和rt180L位点探针、rt180M位点探针；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒拉米夫定耐药毒株，荧光定量PCR方法改进为“2步法”，避免了PCR延伸的步骤；探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

主权项

一种乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：(1)荧光定量PCR反应液：其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCRBuffer、含有Mg2+离子的溶液、rt204位点正向引物、rt204位点反向引物、rt204M位点探针、rt204I位点探针、rt204V位点探针、rt180位点正向引物、rt180位点反向引物和rt180L位点探针、rt180M位点探针；①204位点引物和探针rt204位点正向引物序列为：5′GGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG 3′；rt204位点反向引物序列为：5′TCAAGATGTTGTACAGACTTGGCC 3′；rt204M位点探针序列为：5′CATCATCCATATAACTG 3′；rt204I位点探针序列为：5′CACATCATCAATATAACT 3′；rt204V位点探针序列为：5′TCATCCACATAACTG 3′；②180位点引物和探针rt180位点正向引物为：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′；rt180位点反向引物为：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA 3′；rt180L位点探针序列为：5′CGTTTCTCYTGGCTCA 3′；rt180M位点探针序列为：5′CGTTTCTCATGGCTC 3′；其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝A/G；(2)DNA提取液：①溶液A，为聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris HCl和乙基苯基聚乙二醇；(3)质控品①阴性质控品，为不含外源片段的PSG TS载体质粒DNA；②阳性质控品，检测rtM204I/V(YM/I/VDD)时，为1.0×106copy/mL的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段，检测rtL180M时，为1.0×106copy/mL的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；③临界阳性质控品，检测rtM204I/V(YM/I/VDD)时，为1.0×104copy/mL的含有rt204M/rt204I/rt204V相应基因组的DNA片段，检测rtL180M时，为1.0×104copy/mL的含有rt180L/rt180M相应基因组的DNA片段；(4)工作标准品：检测rtM204I/V(YM/I/VDD)时，为PSG TS rt204的质粒DNA，该质粒是在PSG TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt204M/rt204I/rt204V区间的133个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rtL180M时，为PSG TS rt180的质粒DNA，该质粒是在PSG TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt180L/rt180M区间的151个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。