[发明专利]乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针

摘要

本发明公开了乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及其探针。该试剂盒含有：荧光定量PCR反应液，其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCR Buffer、含有Mg2+离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点和rt236T位点探针；试剂盒中还包括DNA提取液、阴性质控品、工作标准品、阳性质控品和临界阳性质控品。本发明采用实时荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药毒株，荧光定量PCR方法避免了PCR延伸的步骤；探针可以标记多种荧光标记，同时还具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。

主权项

一种乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药核酸定量检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有：(1)荧光定量PCR反应液：其中包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10×荧光定量PCRBuffer、含有Mg2+离子的溶液、rt181位点正向引物、rt181位点反向引物、rt181A位点探针、rt181V位点探针、rt181T位点探针、rtN236T检测试剂盒特有的rt236位点正向引物、rt236位点反向引物、rt236N位点探针和rt236T位点探针；①181位点引物和探针rt181位点正向引物：5′TACAAAACCTTCGGACGGAAA 3′rt181位点反向引物：5′AAAGCCCTRCGAACCACTGA3′rt181A探针序列：5′TTCTCHTGGCTCAGTTT  3′rt181V探针序列：5′TTCTCHTGGTTCAGTTTA  3′rt181T探针序列：5′TTCTCHTGACTCAGTTTA  3′②236位点引物和探针rt236位点正向引物：5′TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTT 3′rt236位点反向引物：5′CCAACTYCCAATTACATATCCCAT 3′rt236N探针序列：5′ATACATTTRAACCC 3′rt236T探针序列：5′ATACATTTRACCCC 3′；其中，上述探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰；所述引物序列中，Y＝(C/T)，R＝(A/G)，H＝A/T/C：(2)DNA提取液：①溶液A，为聚乙二醇6000；②溶液B，其中包括乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、Tris‑HCl、乙基苯基聚乙二醇。(3)质控品①阴性质控品，为不含外源片段的PSG‑TS载体质粒DNA；②阳性质控品，检测rt181时，为1.0×106copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×106copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；③临界阳性质控品，检测rt181时，为1.0×104copy/mL的含有rt181A/rt181V/rt181T相应基因组的DNA片段，检测rt236时，为1.0×104copy/mL的含有rt236N/rt236T相应基因组的DNA片段；(4)工作标准品：检测rt181时，为PSG‑TS rt181的质粒DNA，该质粒是在PSG‑TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt181A/rt181V/rt181T区间的162个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；检测rt236时，为PSG‑TS rt236的质粒DNA，该质粒是在PSG‑TS载体中插入了乙型肝炎病毒基因组中含有rt236N/rt236T区间的153个碱基对的核苷酸片段所得的重组质粒；该2个重组质粒都在大肠杆菌DH5α中增殖。