[发明专利]一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1)淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备；2)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备；3)抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记；4)鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立；5)待检样品中鱼类小清蛋白的检测。本发明能实现对食品中痕量鱼类小清蛋白的检出。

主权项

一种能灵敏检测出淡水鱼主要过敏原小清蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：1） 淡水鱼鲢鱼小清蛋白标准品的制备：将鲢鱼白色肉于Tris‑HCl缓冲液中组织捣碎，离心得到的上清用硫酸铵盐析后，采用离子交换柱过柱收集未吸附部分进行浓缩，然后利用凝胶过滤柱层析，得到纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品；2）抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的制备：将纯化的鲢鱼小清蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合后，筛选获得能分泌抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的细胞株，经腹水诱生法获得大量的单克隆抗体；并通过Protein G Sepharose亲和柱进行纯化； 3）抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体的生物素标记：将单克隆抗体经HiTrap脱盐柱处理，将生物素和经HiTrap脱盐柱处理后的单克隆抗体混匀，于冰上孵育得到生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体；4）鱼类小清蛋白竞争性ELISA检测方法的建立：将步骤1）纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品，配成浓度为200ng/孔，进行96孔板包被；同时采用0.625～10240 ng/mL浓度范围内的步骤1）纯化后的鲢鱼小清蛋白标准品为样品分别与等体积步骤3）制备的生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体同时加入到96孔板包被孔中孵育；以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测，以3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺作为显色剂，用H₂SO₄ 终止后，测定吸光值；并绘制标准曲线；5）待检样品中鱼类小清蛋白的检测：利用步骤1）的方法制备待检样品的标准品，并同样配成抗原浓度为200 ng/孔，然后进行96孔板包被，用TBST洗涤5次后，以5 %脱脂奶封闭，再用TBST洗涤5次；将待检样品和等体积的步骤3）生物素标记的抗鲢鱼小清蛋白单克隆抗体于37 ^oC孵育1 h；TBST洗涤5次后，以辣根过氧化物酶标记的亲和素为二抗进行检测，TBST洗涤5次后，以3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺（3,3’,5,5’‑tetramethylbenzidine，TMB）作为显色剂，用2 M H₂SO₄ 终止后，在96孔板酶标仪测定450 nm的吸光值，将待检样品的OD值换算成B/B₀，其中B为待检标准品各浓度在450 nm的OD值，B₀是空白对照的OD值根据步骤4）绘制的标准曲线即可计算样品中小清蛋白的含量，当其测定的OD值位于标准曲线线性区域内，即为待检样品中有小清蛋白检出，反之即为未检出。