[发明专利]一种适用于转人溶菌酶基因牛、猪的快速简便检测方法

摘要

本发明属于转基因动物中转基因成分的分子检测技术领域，具体涉及提供一种适用于转人溶菌酶基因牛、猪的快速简便检测方法，本发明利用环介导等温扩增法原理，准确快速检测出转基因牛、猪中的人溶菌酶基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供了实用的分子检测方法。

主权项

一种转人溶菌酶基因牛、猪的快速、简便检测方法，其步骤包括：(1)引物设计及合成：根据人溶菌酶的基因序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示：FIP：5’‑GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG‑3’；BIP：5’‑AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC‑3’；F3：5’‑CCTTTCTGTTACGGTCCAG‑3’；B3：5’‑CTCAAAGCCCCTTCTTCT‑3’；(2)环介导等温扩增反应：以引物FIP、BIP为内引物，引物F3、B3为外引物对人溶菌酶基因进行恒温扩增，其反应体系为：1M甜菜碱，400μM dNTPs，2.5μl 10×Bst Buffer，Mg2+2mM，8U Bst NDA聚合酶，1μl模板，外引物F3和B3各0.2μM，内引物FIP和BIP各1.6μM，补双蒸水至25μl，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200μl EP管中，于95℃反应5min，反应后立即冰浴1‑2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61℃反应60min，80℃下反应5min后终止反应；(3)环介导恒温扩增产物检测：1)琼脂糖凝胶电泳：取2μl扩增产物，加入1μl上样缓冲液，该缓冲液包含浓度为40％的甘油、0.2％溴酚蓝和59.8％0.25M Tris‑Hcl，混匀，再按重量/体积计加2％琼脂糖凝胶，于5V/cm下电泳30min，得到凝胶成像，观察是否有梯形条带出现；2)将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5μl的环介导等温扩增产物，再加0.5μlSYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。