[发明专利]一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转基因741杨的方法。本发明以转双抗虫基因741杨的叶片为外植体，将抗逆基因AtNDPK2通过农杆菌导入到转基因741杨中，并对最佳不定芽诱导培养基、继代培养基、最佳生根培养基，以及影响转化的几个因素，例如共培养时间、共培养培养基的pH、最佳潮霉素筛选浓度等进行了研究。本发明利用农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入到转基因741杨中，获得了再生植株。同时建立了高效快速的转基因741杨组培再生体系，转基因741杨叶片的不定芽转化频率可达40％。

主权项

一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法，其特征在于，具体步骤为：I制备侵染菌液挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10～15ml YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取10～100μl的菌液转接至30～50ml的YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养，待菌体OD600达到0.8～1.0时，离心收集沉淀，用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；II转化a.预培养：取转基因741杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄1/3处沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养2天；所述的分化培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；b.共培养：将步骤IIa所得叶片完全浸没在步骤I制备的侵染菌液中10～20min，用无菌滤纸吸干叶片后，转入共培养培养基上，25～27℃进行暗培养3～5天；所述的共培养培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；c.筛选培养：用无菌水冲洗共培养后的叶片，然后用无菌滤纸吸干，将叶块转移到分化筛选培养基上培养，培养温度为25～27℃，光照强度为2500lux，光照时间为14小时/天，培养2‑3周分化出抗性不定芽；所述的分化筛选培养基为：MS+6‑BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L+Hyg3mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；d.继代筛选培养：将步骤c所得抗性不定芽转到继代筛选培养基中进行培养20～30天获得抗性芽，每10天换一次培养基；培养温度为25～27℃，光照强度为2500lux，光照时间为14小时/天；所述的继代筛选培养基为：MS+6‑BA 0.5mg/L+IBA 0.05mg/L+Hyg5mg/L+Cef 400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；e.生根培养：步骤d所得抗性芽长到2～3cm时，切下并插入生根筛选培养基上进行生根培养，培养2‑3周，获得抗性植株；所述的生根筛选培养基为：1/2MS+IBA 0.05mg/L+Hyg5mg/L+Cef400mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L；III鉴定采用CTAB法提取步骤II所获的转化植株的DNA，以PCR法对候选植株DNA进行检测，所用引物如下：上游引物：5′‑ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT‑3′，下游引物：5′‑CCCGGTGAGGTGATTTGAA‑3′；PCR反应条件：94℃1min，54℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min，扩增产物用0.8w％琼脂糖凝胶电泳检测。