[发明专利]一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，该方法包括以下步骤：(1)配制含TBE的聚环氧乙烷筛分介质；(2)提取血液样品中基因组DNA；(3)需检测基因目的片段扩增：将基因组DNA作为扩增模板，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经变性或酶切后分别得到变性样品溶液、酶切样品溶液；(5)样品检测：分别在变性样品溶液和酶切样品溶液中加入10×SYBR Green I荧光染料与基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充聚环氧乙烷筛分介质，分别进行CE-SSCP或CE-RFLP检测即可。本发明操作简单、重现性好。

主权项

一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5～3.5％、pH值为7.5～9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um或0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；(2)血液样品中基因组DNA提取：在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55～57℃水浴孵育2～6h；孵育结束后加入酚‑氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA；所述Tris缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为1∶2～3；所述Tris缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为1∶0.5～1；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1∶0.03～0.05；所述酚‑氯仿与所述血液样品的体积比为1∶1～1.5；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1∶1.5～2.0；(3)需检测基因目的片段扩增：将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k‑ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k‑ras基因PCR扩增样品；(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k‑ras基因PCR扩增样品经94～97℃变性8～10min后，冰浴5～10min，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k‑ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k‑ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k‑ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.5～1.8∶0.2～0.3；所述p53基因PCR扩增样品与所述MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；所述k‑ras基因PCR扩增样品与所述BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；(5)样品检测：①在17～22ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极‑10kv电动进样的方式进行CE‑SSCP检测即可；②在17～22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μ1；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极‑10kv电动进样的方式进行CE‑RFLP检测即可。