[发明专利]甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法

摘要

本发明涉及甘蔗病原菌检测领域，提出甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，包括基因组DNA提取、第一轮PCR扩增、第二轮PCR扩增、PCR扩增产物检测步骤，其中第一轮PCR扩增中采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5，第二轮PCR扩增中采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-L1和Smut-R2，本发明的实质性特点有：1、检测灵敏度极高，即使在甘蔗无黑穗病症状或者感染黑粉菌量极少时也能准确检测出黑穗病菌。2、特异性强，受其他菌类干扰小，准确率高。3、具有耗时短、检测速度快的特点，适用于甘蔗引种检疫、脱毒种苗质量检测及甘蔗黑穗病抗性鉴定早期无症状叶片检测等。

主权项

甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤A、基因组DNA提取：采用CTAB法提取甘蔗叶片或甘蔗黑穗病菌基因组DNA；步骤B、第一轮PCR扩增：以步骤A得到的DNA样品为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；引物序列号：ITS4：5`‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3`；ITS5：5`‑ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG‑3`；PCR反应体系：基因组DNA 1μL，Taq酶0.2μL（5U/μL），10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5μL，各2.5mmol/L dNTPs混合液2μL，5 μmol/L的ITS4引物1μL, 5μmol/L的ITS5引物1μL，灭菌超纯水补足至25μL；PCR扩增程序：预变性94℃，5min；30次循环94℃，30s→56℃，40s→72℃， 1min；延伸反应72℃，10min;保存4℃；步骤C、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut‑L1和Smut‑R2经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物，引物序列号：Smut‑L1：5`‑ CTAGGGCGGTGTTCAGAAGCAC ‑3`；Smut‑R2：5‑ CAGTGCACGAAAGTACCTGTGG ‑3`；PCR反应体系：取1μL第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液作为模板，取5μmol/L的Smut‑L1引物和5μmol/L的Smut‑R2引物各1μL, Taq酶0.2μL（5U/μL），10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5μL，各2.5mmol/L dNTPs混合液2μL，灭菌超纯水补足至25μL；PCR扩增程序：同步骤B的反应程序；步骤D、PCR扩增产物检测：采用凝胶电泳方法对经步骤C得到的PCR扩增产物进行分析。