[发明专利]新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法

摘要

本发明公开了一种新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，将含有血小板生成素拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，将菌体超声破碎，尿素裂解，复性，调pH值，经Protein-AMabselectSuRe层析、SPSepharoseH.P层析和SephacrylS-200分子筛层析进行组合纯化，生产出符合中国药典规定的血小板生成素拟肽蛋白。本发明的有益效果是：复性率高，纯化工艺组合合理，操作程序简化，收率高，生产成本低，为血小板生成素拟肽大规模生产提供可能。

主权项

新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：（1）超声破菌：每克菌体加入10ml预冷TE 缓冲液，所述缓冲液为50mM Tris‑Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至菌体的浓度为1%，充分混匀，温度保持在2~8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron‑100 TE缓冲液洗涤，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述缓冲液为50mM Tris‑Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5；（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；所述包涵体裂解液为6M盐酸胍、50mM Tris‑Hcl和8mM DTT中的一种或多种，所述包涵体裂解液的pH值为9.0；（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1~2mg/ml，在2~8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris‑Hcl和1.5M尿素稀释1~5倍；（5）调节PH和离心：用醋酸调节pH值至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；（6）将溶液依次进行Protein‑A Mabselect SuRe层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S‑200分子筛层析。