[发明专利]一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法

摘要

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，首先分离广西尖吻蝮蛇毒腺组织，构建噬菌体展示文库，以纤维蛋白/纤维蛋白原为底物，经过三轮淘选，获得了一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因。本发明还构建了尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的原核表达载体pET-32(a)-TLE，诱导表达、亲和纯化和分子筛纯化后，获得了具有生物学活性的重组蛇毒类凝血酶蛋白。该酶可用于制备心血管溶栓药物。

主权项

一种蛇毒类凝血酶蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备蛇毒类凝血酶基因：a)小心分离新鲜蛇毒毒腺，提取组织RNA，并进一步提取分离mRNA，反转录获得cDNA；b)cDNA双链进行末端补平，补平后的cDNA末端加上EcoR I和Hind III酶切位点；c)已加酶切位点的cDNA双链片段用EcoR I和Hind III限制性内切酶酶切，酶切片段连入T7载体，连接产物加入到包装蛋白中进行噬菌体体外包装；d)以纤维蛋白原作为特异性底物淘选噬菌体：将纤维蛋白原稀释至浓度为10μg/ml，用封闭液将其包被在ELISA板上；包被好的ELISA板，每孔加入包装好的噬菌体100μl，室温孵育2小时；用TBST溶液洗板5次，加洗脱液在室温孵育20分钟，从ELISA板上洗脱噬菌体，完成第一轮淘选；再按上述方法以第一轮淘选噬菌体为基础，再进行两轮淘选，获得强亲和性的含目的基因的噬菌体群；e)从上述噬菌体群中分离培养单个的噬菌体，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，PCR扩增获得蛇毒类凝血酶基因，如SEQ ID NO：1所示；(2)将蛇毒类凝血酶基因克隆入质粒载体中，构建原核表达载体；(3)用原核表达载体转化大肠杆菌；(4)挑取含表达载体的单克隆菌株在37℃下过夜振荡培养至A600＝0.6 0.8，加异丙基 β D 硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.7mmol/L，18℃振荡培养8小时，诱导表达蛇毒类凝血酶蛋白；(5)收集菌体， 80℃冻存；重新取出菌体，加入裂解液，搅匀，冰上超声破菌；(6)在4℃，8000g下离心10分钟，收集上清，进一步纯化制备类凝血酶蛋白。