[发明专利]鲫肝细胞原代培养方法

摘要

本发明提供了一种新的鲫肝细胞原代培养方法。它主要包括以下步骤：a、从鲫中分离出肝组织；b、采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团；c、对获得的细胞团进行纯化和培养。本发明方法原料来自于常见水生实验动物鲫，用葡萄糖洗必泰（氯苯双胍己烷）浸泡离体组织块，对离体的组织块进行消毒，减少污染。利用分步消化法对组织进行消化，使用红细胞裂解液降低细胞中血细胞的含量，并用Percoll梯度离心，纯化肝细胞。联合取材、分步消化法、红细胞裂解液以及Percoll四种方式纯化肝细胞，本发明得到的肝细胞数量充足，且存活率达90%以上，符合原代培养的要求。

主权项

1.一种鲫肝细胞原代培养方法，它包括以下工艺步骤：a.从健康的鲫中分离肝组织首先剪断鲫鳃部脉弓，放血处死，用酒精擦拭鲫体表进行消毒，在超净工作台内解剖鲫，并取出肝组织，将分离的肝组织浸泡于葡萄糖洗必泰中10min；b.采用分步消化法对剪碎的肝组织进行消化获得细胞团将浸泡过葡萄糖洗必泰的组织用D-hank’s漂洗2次，剪碎成2-3mm³的组织块；为了提高消化效果采用分步消化法消化组织：将剪碎的组织倒入离心管，置入28℃的水浴锅内；首先加入组织量4-5倍体积的胰蛋白酶和EDTA消化，期间不停摇匀，15min消化完毕后，离心弃上清；加入3ml的D-hank’s同底部沉淀混匀后离心弃上清，将残留的胰蛋白酶和EDTA去除，终止消化；向所得沉淀组织中加3-4倍体积的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂置入28℃水浴锅，期间不停摇匀，每隔10min后取出3/4的上清液移入另一个离心管；在烧杯中添加新的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂继续消化组织块；30min消化完毕后，将收集的上清液细胞悬液通过200目孔径不锈钢滤网，滤掉组织块；离心弃上清，加入3ml的无血清培养基同底部沉淀混匀后离心弃上清，将残留的Ⅱ型胶原蛋白酶和CaCl₂去除，终止消化；c. 对获得的细胞团进行纯化和培养 ①使用红细胞裂解液去除血细胞：向离心管中加10ml D-hank’s，将沉淀细胞团用移液器吹打分散成单个细胞悬液，同时加1ml的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，上下颠倒6-8次，静置5min；离心倒弃红色部分，留下管底白色细胞团；加D-hank’s同白色细胞团混匀，吹打并离心，溶解于3ml的D-hank’s配成肝细胞悬液；②加Percoll试剂对分离的肝细胞纯化：取肝细胞悬液悬浮于2.5倍体积的Percoll分离液Ⅱ上，离心弃上清；取沉淀细胞团用5ml的D-hank’s重悬，枪头吹打混匀；1500rpm，5min离心，弃上清，得到纯化过后的肝细胞；其中，所述的D-hank’s溶液为：将8g NaCl、0.4g KCl、0.13g Na₂HPO₄·12H₂0、0.06g KH₂PO4、0.35g NaHCO₃定容于1L纯水中，高温高压灭菌，待温度下降后于4℃保存；其中所述的用Percoll分离液Ⅱ配制为：先用Percoll试剂原液和10×D-hank’s以9:1的比例配置分离液Ⅰ，用配置成的分离液Ⅰ和1×D-hank’s按2:3的体积比配置成所需的分离液Ⅱ；将纯化后的肝细胞用培养基再悬浮，其中所述的培养基为：DMEM/F12培养基中加入20%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml的链霉素以及20ug/ml促肝细胞生长因子。