[发明专利]一种获得诱导性多能干细胞的方法

摘要

本发明提供一种获得诱导性多能干细胞的方法，利用p53siRNA、VPA和Vc联合Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc之间的协同作用，有效抑制p53蛋白表达，降低细胞凋亡，促进多能基因Oct4表达，改变细胞周期，获得高效诱导性多能干细胞。本发明方法获得的诱导性多能干细胞可促进了多能干细胞在药物筛选、疾病机理研究、生物组织工程、细胞移植等生物学领域的应用。

主权项

一种获得诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：(1)细胞制备选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取骨髓，通过密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得人骨髓间充质干细胞，选择生长状态良好的人骨髓间充质干细胞，用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；(2)获得诱导性多能干细胞利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc的病毒和p53干涉RNA病毒转染，并在培养系统中加入组蛋白去乙酰基酶抑制剂丙戊酸钠和维生素C的人骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc的病毒单独处理或病毒分别联合p53干涉RNA、丙戊酸钠、维生素C或丙戊酸钠+维生素C的人骨髓间充质干细胞作为对照组，以确定p53干涉RNA、丙戊酸钠、维生素C的不同组合联合病毒转染人骨髓间充质干细胞获得诱导性多能干细胞的效率；病毒包装按照常规方法进行，利用脂质体2000转染试剂盒进行293T细胞转染，孵育24‑72小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的人骨髓间充质干细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1∶5比例加入培养系统中，进行病毒转染，实验组和相应的对照组同时进行p53干涉RNA病毒转染，病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，实验组中的培养基加入丙戊酸钠和维生素C，对照组中的培养基或加入丙戊酸钠或加入维生素C或丙戊酸钠+维生素C或什么都不加，丙戊酸钠连续加7天，维生素C加到克隆形成，对克隆进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。