[发明专利]同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用

摘要

本发明公开一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法与应用。本发明将螺旋藻干粉反复冻融，超声破碎，离心，上清为藻胆蛋白粗提液；接着加入硫酸铵，饱和度为25～35％时取上清；再加入硫酸铵，饱和度为60～70％时取沉淀，透析沉淀，得到初步纯化的藻胆蛋白提取液，将其上样到羟基磷灰石柱子；收集含0.1～0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶液和含0.1～0.2M氯化钠的pH6.5～7.2、0.1～0.12M磷酸盐缓冲溶液，前者为藻蓝蛋白，后者为别藻蓝蛋白。该制备方法能同时获得纯化因子达到4.5的藻蓝蛋白和3的别藻蓝蛋白及其含硒、碲类似物，并对其纯化规模进行放大，一次层析可获得克级的高纯度蛋白，大大降低纯化成本，能用于生产藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。

主权项

一种同时分离高纯度的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)将螺旋藻干粉溶于磷酸盐缓冲溶液中，反复冻融，超声破碎，离心，上清为藻胆蛋白粗提液；(2)使用硫酸铵盐析法初步纯化藻胆蛋白粗提液，具体如下：0℃下加入饱和度为25～35％的硫酸铵溶液盐析去除杂蛋白，得到的上清液用0℃下饱和度为60～70％的硫酸铵溶液盐析，得到的沉淀用磷酸盐缓冲溶液溶解并置于透析袋中，于磷酸盐缓冲溶液中透析过夜，将透析液离心，取上清，得到初步纯化的藻胆蛋白提取液；(3)羟基磷灰石的制备、装柱及平衡：将氯化钙和磷酸氢二钾按摩尔比1∶1以相同的速度匀速滴入装有相同浓度的氯化钙溶液中；滴加完毕后，静置沉淀，倾去上清液，沉淀用水冲洗；接着用氢氧化钾溶液调节沉淀的pH＞8，放置12～24小时后，用水冲洗沉淀，弃去细小颗粒，装柱，然后用磷酸盐缓冲溶液平衡；(4)将步骤(2)得到的初步纯化的藻胆蛋白提取液上样到步骤(3)制备的平衡后的羟基磷灰石柱子，上样量为柱床体积的1/3～1/2；上样完毕后用含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度分别为0.005～0.01M、0.02～0.03M、0.04～0.06M和0.1～0.12M；(5)收集含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.02～0.03M磷酸盐缓冲溶液和含0.1～0.2M氯化钠、pH6.5～7.2的0.1～0.12M磷酸盐缓冲溶液，前者为藻蓝蛋白，后者为别藻蓝蛋白；分别进行冷冻干燥，保存；步骤(1)～(3)中所述的磷酸盐缓冲溶液为0.5～10mM、pH 6.5～7.2的磷酸盐缓冲溶液。