[发明专利]双齿围沙蚕金属结合蛋白基因的克隆方法

摘要

本发明公开一种双齿围沙蚕金属结合蛋白基因的克隆方法，是通过设计特异性片段扩增和RACE扩增的方法，从双齿围沙蚕体壁肌肉总RNA中克隆得到了双齿围沙蚕的金属结合蛋白基因，可利用实时荧光定量PCR技术检测双齿围沙蚕在受到重金属等污染物胁迫下MPⅡ基因表达的规律，为探讨重金属对双齿围沙蚕MPⅡ基因调控的作用机理提供依据，亦为筛选海洋沉积环境污染早期生态风险预测的分子生物标志物奠定基础，利于成本低、来源丰富的双齿围沙蚕在环境保护中广泛应用。

主权项

一种双齿围沙蚕金属结合蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下列步骤进行：a. 提取及纯化双齿围沙蚕总RNA，合成cDNA第一链；b. 应用一对引物通过聚合酶链式反应对双齿围沙蚕cDNA第一链进行扩增：所述正向引物5′‑CGAGTCCTTCCAGGTCTTC‑3′，所述反向引物5′‑TCGGTCTTCTTCTTGTGGG‑3′；c. 应用5′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行5′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA5′端序列；所述5′ RACE PCR正向引物：5′‑CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA‑3′；所述5′ RACE PCR反向引物：5′‑CTTGAGGTTGTTAGCGTTGTTTC‑3′；d. 应用3′ RACE PCR引物对聚合酶链式反应产物，进行3′ RACE扩增，得到双齿围沙蚕cDNA3′端序列；所述3′ RACE PCR正向引物：5′‑TGGAAACAACGCTAACAACCTCA‑3′；所述3′ RACE PCR反向引物：5′‑ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC‑3′；e. 将双齿围沙蚕cDNA5′端序列与双齿围沙蚕cDNA3′端序列拼接，即获得双齿围沙蚕金属结合蛋白基因。