[发明专利]转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法

摘要

本发明公开了一种转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，利用转基因抗虫水稻秸梗浸泡液培养草履虫，通过对培养草履虫细胞密度的统计来确定转基因水稻是否对草履虫的生长、繁殖等产生影响；再利用彗星电泳技术检测草履虫DNA的损伤，统计分析实验组、阴性对照组和阳性对照组三者的彗星细胞数来确定抗虫转Bt基因水稻对草履虫DNA的损伤情况；从而来判断转基因抗虫水稻对土壤环境是否安全。本发明根据转基因抗虫水稻对草履虫生长的细胞密度和DNA损伤的影响，间接评价转Bt基因抗虫水稻释放对土壤环境的安全性，实验操作简单，不需要复杂的仪器设备和繁琐的操作步骤。

主权项

转基因抗虫水稻土壤环境安全的评价方法，其特征是包括以下步骤：1)、转基因抗虫水稻水浸泡液和和非转基因水稻水浸泡液的制备：在转基因抗虫水稻秸梗中按照1g/20～30ml的料液比加入蒸馏水，于25～27℃浸泡3.5～14天，过滤，得转基因抗虫水稻水浸泡液；在非转基因水稻秸梗中按照上述相同的料液比加入蒸馏水，于上述相同的温度浸泡相同的时间，过滤，得非转基因水稻水浸泡液；2)、草履虫母液的培养；将普通水稻秸梗按照1g/20～30ml的料液比加入蒸馏水，煮沸至少0.5小时，过滤，得普通水稻水浸煮沸液；将大草履虫放入所述普通水稻水浸煮沸液中进行培养，得草履虫培养母液；所述草履虫培养母液中草履虫的密度为(0.8～1.2)×103ind/mL；3)、用转基因抗虫水稻水浸泡液和非转基因水稻水浸泡液分别培养草履虫：将草履虫培养母液按照1∶90～110的体积比加入至转基因抗虫水稻水浸泡液中作为转基因培养液，于25～27℃恒温培养6～8天；将草履虫培养母液按照相同的体积比加入至非转基因水稻水浸泡液中作为非转基因培养液，于上述相同的温度培养相同的时间；4)、草履虫细胞密度的计数：从上述步骤3)所述培养的第2天起，每天对上述转基因培养液以及非转基因培养液进行草履虫细胞密度的检测；5)、当上述步骤4)的转基因培养液中的草履虫细胞密度≥1×103ind/mL，取该转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的转基因细胞培养液；当上述步骤4)的非转基因培养液中的草履虫细胞密度≥1×103ind/mL，取该非转基因培养液作为草履虫DNA的损伤检测的非转基因细胞培养液；6)、密度差异进行数据分析：将步骤4)所得的非转基因培养液的草履虫细胞密度相对于相同培养天数所得的转基因培养液的草履虫细胞密度进行单因素方差分析，如果P＞0.05，则继续进行下述步骤7)；如果P≤0.05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全；7)、对草履虫DNA的损伤检测，依次进行以下步骤：A)、将转基因细胞培养液制成细胞密度(0.8～1.2)×105ind/mL的转基因细胞悬浮液，将非转基因细胞培养液制成细胞密度相同的非转基因细胞悬浮液；B)、取2份非转基因细胞悬浮液，其中一份作为阴性对照；在另一份中加入双氧水进行染毒，作为阳性对照；C)、彗星电泳技术，依次进行以步骤：①、对转基因细胞悬浮液、阴性对照和阳性对照分别进行彗星电泳技术，依照彗星电泳的判断标准，分别得转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据、阴性对照的彗星电泳判断数据和阳性对照的彗星电泳判断数据；②、预先的实验有效性的判断：如果，阳性对照的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P＞0.05，则判定该彗星电泳实验无效；如果，阳性对照的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P≤0.05，则判定该彗星电泳实验有效，从而继续进行以下步骤③；③、得出结论：如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阴性对照的彗星电泳判断数据相比的P＞0.05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境安全；如果，转基因细胞悬浮液的彗星电泳判断数据与阳性对照的彗星电泳判断数据相比的P＞0.05，则判定所述转基因抗虫水稻对土壤环境不安全。