[发明专利]利用天然油体重构法制备固定化脂肪酶用于生产生物柴油

摘要

本发明是一种利用天然油体重构法同步纯化和固定化脂肪酶的方法，该方法是利用天然油体崩解后能自发重构的特点，将表达有融合蛋白脂肪酶油体蛋白的大肠杆菌与天然油体按比例混合后超声处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的油体半单位膜上，形成含有脂肪酶的重构油体，从而达到脂肪酶纯化和固定化同步完成的目的。该发明提供了一种全新的可用于生产生物柴油的脂肪酶固定化技术，解决了当前酶法生产生物柴油过程中固定化脂肪酶成本高、效率低的缺点，制备工艺简单；本发明首次采用天然油体作为固定化酶的基质，成本低廉、底物适应性广泛，并显著提高脂肪酶的稳定性以及对低元醇的耐受能力。

主权项

一种使用天然油体作为固定化酶基质以制备固定化脂肪酶来生产生物柴油的方法，其特征在于该方法步骤如下：利用天然油体崩解后能自发重构的特点，以油脂植物总mRNA的反转录产物cDNA为模板，采用PCR法获得的400~1000bp的油体蛋白基因，标记为O；以根据文献《廉价油脂青睐型脂肪酶产生菌株的筛选及其鉴定》的方法获得的产脂肪酶微生物基因组为模板采用PCR法获得信号肽缺失的脂肪酶及其伴侣蛋白基因的ORF序列，标记为Lipd25AB；利用《分子克隆实验指南3》上基因工程的方法构建油体蛋白和脂肪酶及其伴侣蛋白表达载体pET32(a+)‑O‑Lipd25AB；将该原核表达载体转入表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中，获得用于表达融合蛋白（油体蛋白‑脂肪酶）的工程菌株E.coli BL21(DE3) ‑O‑Lipd25AB；将诱导表达的工程菌株与天然油体按比例混合后解构处理，利用油体蛋白的特异疏水性使融合蛋白锚定到新组成的油体半单位膜上，形成含有脂肪酶的重构油体即固定化脂肪酶；利用所制备的固定化脂肪酶催化动植物油脂的转酯反应获得生物柴油。