[发明专利]一种包埋-交联磷脂酶A1聚集体的方法

摘要

本发明提供一种固定化磷脂酶A1的方法，在交联酶聚集体技术基础上进行改进，先将游离磷脂酶A1制成交联酶聚集体，再将得到交联酶聚集体进行包埋，得到固定化磷脂酶A1。研究了酶液浓度、沉淀剂饱和度、沉淀pH、沉淀时间、交联剂浓度、交联时间、海藻酸钠浓度和钙离子浓度等不同固定化条件对磷脂酶固定化效率和催化效果的影响，并对固定化酶膜的酶学性质进行了讨论。通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释利用包埋-交联聚集体的方法固定化磷脂酶的优势。根据本包埋-交联酶聚集体化学稳定性和机械性能优异等特性固定化磷脂酶，提高了酶在反应体系中的活性和稳定性，调节和控制酶的活性与选择性，从而有利于酶的回收和保持较高的酶活回收率，最终得到的固定化酶活回收率为80.2％，重复使用7次相对酶活力保留在65％以上。

主权项

一种包埋‑交联磷脂酶A1聚集体的方法，其特征在于用包埋‑交联酶聚集体来固定磷脂酶的方法通过以下步骤实现：一、磷脂酶A1的固定化：1、磷脂酶A1聚集体的制备：将1mL酶加入到一定量的pH值为5.0的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中，在0℃下缓慢加入无水乙醇并持续搅拌，从而保证酶聚集体颗粒均匀。冰浴反应一段时间，然后于10000rpm离心，收集沉淀。2、交联磷脂酶A1聚集体的制备及包埋过程：向聚集体悬浮液中加入一定浓度的戊二醛，搅拌反应一段时间，离心去除上清液，用缓冲液冲洗交联酶聚集体数次，直到洗液中检测不到任何的活力，收集沉淀用磷酸盐缓冲液悬浮。在一定浓度的20mL海藻酸钠溶液中加入上述酶聚集体1mL，搅拌均匀。静止一段时间后，用灭菌后的5mL注射器吸入上述混合液，以约5滴/s注入一定浓度CaCl2溶液中制成微胶囊，将形成的微胶囊在4℃的CaCl2溶液中放置一段时间使其进一步硬化。然后抽滤得到硬化的微胶囊，用无菌生理盐水洗涤3～5次，以洗去表面的CaCl2，然后进行冷冻干燥备用。二、酶活力的测定：一定量的底物无油磷脂溶于预定pH值的缓冲液中，经磁力搅拌器充分搅拌，混合均匀。取4个100mL三角瓶，2个作为空白瓶，2个作为样品瓶，各加底物溶液25mL，再于空白瓶中加入95％乙醇15mL，于预定温度的水浴中预热5min，然后在各瓶中加入一定质量的经复水后的固定化酶，立即混匀计时，在预定温度的水浴中180r/min的条件振荡准确反应15min，然后于样品瓶中立即补加95％乙醇15mL终止反应，取出，用微量滴定管和配置好的NaOH标准溶液滴定，计算标准碱液平均消耗量。三、固定化条件的优化：分别在酶液浓度0.02～0.07g/mL、沉淀剂饱和度65～90％、沉淀pH3～8、沉淀时间15～65min、交联剂浓度0.1～0.6％、交联时间3.5～8.5h、海藻酸钠浓度0.5～3％、钙离子浓度0.1～0.35mol/L的条件下，通过测定固定化酶活力得到最佳的固定化条件。四、固定化酶酶学性质的讨论：在温度40～70℃，PH 4.5～7范围内，通过测定固定化酶和游离酶的活力，得出固定化酶的最适温度，最适pH值。并通过重复测定酶活来讨论固定化酶的使用稳定性。五、通过固定化酶膜的SEM图像进一步解释包埋‑交联磷脂酶A1聚集体的优势。