[发明专利]一种获得造血干细胞的方法

摘要

本发明提供一种获得造血干细胞的方法，是利用成分确定的中胚层诱导因子联合造血细胞因子或血管内皮生长因子等诱导来源于人骨髓单个核细胞重编程的诱导性多能干细胞分化为具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞，建立了高效获得造血干细胞的方法。本发明方法为获得高效、成分确定、具有造血细胞和内皮细胞功能的造血干细胞提供技术保障，为获得临床可用的造血干细胞提供了理论基础和技术平台，并积极促进诱导性多能干细胞及其诱导的造血干细胞在药物筛选、疾病机理研究、临床应用、生物组织工程等领域的研究与开发。

主权项

一种获得造血干细胞的方法，通过以下技术方案实现：（1）细胞制备：取骨髓，密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得单个核细胞，选择生长状态良好的单个核细胞，用于诱导性多能干细胞的制备；获取胎鼠成纤维细胞，选择生长状态良好的胎鼠成纤维细胞，丝裂霉素C处理，作为制备诱导性多能干细胞的饲养层；（2）诱导性多能干细胞制备利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc的病毒转染生长状态良好的单个核细胞；病毒包装利用脂质体2000转染试剂盒转染293T 细胞进行，孵育24‑72小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的单个核细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1：5比例加入培养系统中，进行病毒转染，病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，待克隆形成，挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞，继续向造血干细胞进行分化；（3）分化获得造血干细胞根据诱导因子功能的不同，分成四组，分阶段高效诱导诱导性多能干细胞为造血干细胞，并检测获得的造血干细胞向造血细胞和内皮细胞方向分化的潜能；第一组诱导因子有中胚层诱导因子BMP‑4、PD98059和部分早期造血因子SCF、Flt3L、 VEGF，第二组细胞因子为造血因子和促进造血干细胞增值的细胞因子SCF、Flt3L、 VEGF、IL‑3、IL‑6，第三组细胞因子为刺激造血干细胞在半固体培养基中形成不同细胞集落和不同造血细胞的因子，有SCF、VEGF、IL‑3、IL‑6 、TPO、 EPO 、G‑CSF、GM‑CSF，第四组为刺激造血干细胞向内皮细胞分化的VEGF‑A；第一组细胞因子BMP4、PD98059、SCF、Flt3L、VEGF处理后收集的拟胚体中，含有高比例的中胚层转录因子Brachyury 和GATA‑2；将第一组细胞因子处理后收集的拟胚体分散成单细胞悬液，种植在低粘附的培养皿中，培养基为含有SCF、Flt3L、VEGF、bFGF、IL‑3、IL‑6、L‑谷氨酰胺、b‑巯基乙醇、非必须氨基酸的造血干细胞培养基StemPro‑34，处理7‑9天后获得高达19.58±4.37%的造血干细胞。