[发明专利]一种桑黄菌丝体的制备方法

摘要

本发明的目的在于提供一种桑黄菌丝体的制备方法。步骤包括桑黄菌种活化；马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养；刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养；收集桑黄菌丝体；提取桑黄菌丝体总RNA；琼脂糖凝胶电泳观察结果。本发明使用的菌种是保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)桑黄菌种(鲍姆层孔菌，保藏号为桑黄DL101 CCTCC M 2011137)。本发明操作简单，原理易懂，为今后获得大规模的、高纯度的桑黄菌丝体和高质量的桑黄总RNA提供了简便快捷的方法，也为桑黄的基础研究和应用开发奠定了基础。

主权项

一种桑黄菌丝体的制备方法，其特征在于：步骤如下：步骤一：桑黄菌种活化：将保存在冰箱里的桑黄菌种用马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面活化，首先将从4℃冰箱里拿出来的桑黄菌种在室温下放置一段时间，达到与室温一致即可，然后在超净工作台内进行马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面接种，每个试管斜面只接一个点，盖上胶塞，放置在25℃温箱里恒温避光培养5‑7天；步骤二：马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板培养：将已活化的桑黄菌种转接到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，在超净工作台内，用接种钩挑取马铃薯葡萄糖琼脂培养基试管斜面上边缘生长旺盛的桑黄菌丝体，接于平板中间，每个平板只接一个点，用封口膜封上置于25℃温箱里恒温避光培养7‑9天；步骤三：刮取桑黄菌丝体接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中进行振荡培养：将要长满平板的年轻桑黄菌丝体进行刮取并接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，首先，要选择几乎长满平板但还没有老化变黄的桑黄菌丝体作为接种材料，因为这样的菌丝体更易于刮取；用灭过菌的小钥匙进行刮取，刮的时候不要太用力，只刮取桑黄菌丝体，不要连带培养基，刮取下来的桑黄菌丝体在马铃薯葡萄糖液体培养基里以涮的方式进行接种，接入250ml三角瓶中，每瓶接入1‑2个平板的桑黄菌丝体；封瓶膜封口后，置于恒温振荡器120r/min，25℃恒温避光振荡培养5‑7天；步骤四：收集桑黄菌丝体：在马铃薯葡萄糖液体培养基尚未变色之前进行桑黄菌丝体收集，将三角瓶里的桑黄菌丝体，进行10层纱布过滤，用无菌蒸馏水冲洗桑黄菌丝体2‑3遍，冲掉残留的马铃薯葡萄糖液体培养基，带上一次性手套将纱布拧干，拧到桑黄菌丝体在纱布上略微粘起的程度即可，用灭过菌的镊子将桑黄菌丝体从纱布上小块地撕取下来，放入2mL的离心管中，不要放得太实，装入量为离心管的1/3即可，置于‑70℃保存，备用；步骤五：提取桑黄菌丝体总RNA将步骤四中在‑70℃里2mL离心管中保藏的桑黄菌丝体取出，置于用液氮冷却过的研钵里充分研磨至粉状，迅速分装到盛有1.0mLTrizol试剂的1.5mL无菌离心管中；用振荡器振荡3‑5min，放回冰盒；加200μL氯仿，振荡5min再放回冰盒静置3‑5min；离心，12000rpm，15min；取新的1.5mL无菌离心管加600μL氯仿，将离心后的上清液加进来，振荡3‑5min，保证液体能悬浮起来，静置1min；离心，12000rpm，10min；取新的1.5mL无菌离心管加500μL异丙醇，将离心后的上清液加进来，振荡1min，混匀；放冰上，静置10min，沉淀，离心12000rpm，10min；去除上清液，留沉淀，加200μL的DEPC水溶解沉淀，用等体积的氯仿抽提2次，离心，12000rpm，5min，每次离心后取上清液，第二次离心后得到的上清液即为我们所需的桑黄总RNA样品；电泳检测，用凝胶成像系统观察结果；剩下的桑黄总RNA样品加入4倍体积的无水乙醇，再滴加几滴3mol/L的乙酸钠溶液，混匀，冰上静置10min，12000rpm，离心10min，放于‑70℃保存；步骤六：琼脂糖凝胶电泳观察结果称取1.6g琼脂糖于小三角瓶中，加入20mL的1×TAE，微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀；当温度降到50度左右时向小三角瓶中加入1μL的溴化乙锭，振荡混匀；趁热倒入洗净的制胶槽中，形成模子，将制胶槽置于水平位置并固定放好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固，即得到琼脂糖凝胶，垂直轻拔梳子，将琼脂糖凝胶及内槽放于电泳槽中，备用；在点样板上，将3μL步骤五中的桑黄总RNA样品与2μL的上样缓冲液混合均匀，用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个桑黄总RNA样品，应更换一个新枪头，以防污染，加样时，勿碰坏样品孔周围的凝胶面，加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压80‑100V，样品由负极向正极方向移动，当上样缓冲液中的溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm时，停止电泳，电泳完毕后，取出琼脂糖凝胶，放于凝胶成像系统中，紫外线下观察并拍照保存。