[发明专利]一种分离牛外周血单核细胞的方法

摘要

本发明提供了一种优化的分离牛外周血单核细胞的方法，包括以ACD-A作为抗凝剂、离心条件的优化、细胞清洗条件的优化、贴壁条件的优化等，大大提高了分离成功率。本发明首次建立了从牛血采样到分离牛外周血单核细胞并最终转化为巨噬细胞的一整套完备体系，中间不需要计数和染色，节省了时间并提高了分离效果。采用本发明方法分离出的单核细胞存活率高，实验重复性好，可操作性强，为简便高效地分离牛外周血中的单核细胞提供了有力的技术支持。

主权项

一种分离牛外周血单核细胞的方法，其特征在于，包括步骤：1)向含有抗凝剂ACD‑A的离心管中加入采集到的牛外周血，制成抗凝血液；2)将OptiPrepTM原液与C液按比例混合，制成密度分离液；3)将1)的抗凝血液与PBS溶液按比例混合，制成稀释的抗凝血液；4)将2份体积的3)稀释的抗凝血液加在1份体积的2)的密度分离液之上，离心，弃上清，将分离液和血清液面交界处的白色薄层转移至另一离心管中；5)向4)的离心管中加入PBS溶液清洗细胞，然后以转速250g离心5‑10min；6)向5)的细胞沉淀中加入PBS溶液重悬，即得单个核细胞；其中，2)中所述的C液的制备方法为：将1.79g Tricine Buffer加入100ml水中，制得100mM Tricine储存液，4℃保存；将0.85g NaCl加入50ml水中，加入20ml 100mM Tricine储存液，用1M NaOH调节pH值7.4，加水补充体积至100ml，0.22μm滤器过滤除菌。